[发明专利]一种脐带组织块冻存、复苏以及制备间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种脐带组织块冻存、复苏以及制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)用消毒液对脐带组织表面进行消毒，将脐带剪开，平铺，用缓冲液清洗脐带组织；

(2)将步骤(1)获得的脐带组织剪成组织段；

(3)剥离所述组织段的华通胶，将华通胶置于洁净的离心管内，用手术剪剪成块状；

(4)向所述块状组织中加入无血清培养基，无血清培养基的体积为所述块状组织体积的二分之一，重悬块状组织后加入与无血清培养基等体积的预冷冻存液，分装至冻存管中；

(5)将步骤(4)获得的含有块状组织的冻存管先后在4℃下冷藏0.5小时，-20℃冷藏2小时，-80℃下冷冻1天，最后在-196℃液氮中冷冻备用；

(6)需要时将步骤(5)冷冻的块状组织从液氮中取出，在恒温水浴中解冻，用移液管吸取解冻的组织块，放入洁净的离心管中，加入无血清培养基混匀，然后于低温离心，去掉上清液；

(7)将步骤(6)离心后的块状组织接种至明胶铺被的培养皿中，加入无血清培养基后放入CO₂培养箱内培养；以及

(8)培养后的3～5天进行第一次换液，以后4～5天换一次液，待细胞融合度达到70％以上后，使用胰蛋白酶进行消化后传代，即获得脐带间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消毒液为体积百分浓度75％的酒精；所述缓冲液为含有氨基青霉素和硫酸链霉素的PBS缓冲液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织段的长度2～4cm；所述块状的表面积为1～2mm³。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预冷冻存液包含二甲基亚砜。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以体积计，所述无血清培养基包括以下成分：

α-MEM10.3g/L、碳酸氢钠2.3g/L、碳酸钠1.8g/L、磷酸一氢钠2.0g/L、磷酸二氢钠1.7g/L、L-谷氨酰胺2-8mM、重组人白蛋白2-6g/L、重组人转铁蛋白10-15mg/L、重组人胰岛素5-10mg/L、β-巯基乙醇50nM、谷胱甘肽0.1-3mg/L、对氨基苯甲酸0.5-5mg/L、维生素B 25-40mg/L、维生素C 20-50mg/L、黄体酮10-20ng/mL、腐胺5-10mg/L、肝素5-10IU/mL、EGF5-10ng/mL、b-FGF 6-10ng/mL、HGF 6-10ng/mL、VEGF 6-10ng/mL、脂质0.1-1mg/L、微量元素1-8mg/L以及式I化合物6-12μM。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述式I化合物的结构式如下：

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述脂质包括胆固醇、花生四烯酸、原儿茶酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸中的一种或多种的组合。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述微量元素包括Mg、Cu、Zn、Se、Fe、Sn、Ge、Rb、Co和Mn中的任意一种或多种的组合。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括步骤：

(9)针对步骤(8)所得脐带间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；或

(10)将步骤(8)所得传代后的脐带间充质干细胞于液氮中冻存，备用。

10.一种建立脐带干细胞数据库的方法，其特征在于，所述方法包括权利要求1-9任一项所述方法的步骤，以及以下步骤：将传代后的细胞于液氮中冻存并记录相关胎儿信息，并进行细胞的生物学特性及多向分化潜能鉴定，以及对细胞进行分子遗传学诊断，保存细胞的所有相关数据，建立脐带干细胞的数据库并与冻存细胞进行关联。