[发明专利]一种褐藻胶裂解酶、分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞及其应用

权利要求书

1.一种褐藻胶裂解酶，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括D-丙氨酸消旋酶启动子、D-丙氨酸消旋酶基因、褐藻胶裂解酶基因启动子、编码信号肽的基因和如权利要求2所述的褐藻胶裂解酶的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶基因启动子包括hpaII启动子、p43启动子或pglv启动子中的任意一种或至少两种的组合。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶基因启动子为hpaII启动子。

6.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述信号肽包括褐藻胶裂解酶信号肽98sp、yuiC信号肽、csn信号肽、yesW信号肽、bpr信号肽、lipA信号肽、lipB信号肽、nprB信号肽、nprE信号肽、amyE信号肽、yfk信号肽、wap信号肽、yclQ信号肽、oppA信号肽或pel信号肽中的任意一种或至少两种的组合。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述信号肽为褐藻胶裂解酶信号肽98sp、yuiC信号肽或pel信号肽中的任意一种或至少两种的组合。

8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶信号肽98sp的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

9.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述编码信号肽的基因和如权利要求2所述的褐藻胶裂解酶的核苷酸序列以基因融合方式连接。

10.一种分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建敲除D-丙氨酸消旋酶基因的宿主细胞；

(2)构建褐藻胶裂解酶分泌表达载体，将D-丙氨酸消旋酶启动子及基因、褐藻胶裂解酶基因启动子、编码信号肽的基因和如权利要求2所述的褐藻胶裂解酶的核苷酸序列连接到表达载体上；

(3)将步骤(2)所述的表达载体导入步骤(1)所述的敲除D-丙氨酸消旋酶的宿主细胞中。

11.根据权利要求10所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述构建敲除D-丙氨酸消旋酶基因的宿主细胞的方法为：

利用同源重组的方式构建敲除载体对D-丙氨酸消旋酶基因进行敲除，所述敲除载体包括宿主细胞的D-丙氨酸消旋酶基因的上下游核苷酸序列作为同源重组的同源臂、抗生素基因、及木糖启动子控制表达的插入大肠杆菌致死因子基因；然后将敲除载体导入宿主细胞，利用抗生素筛选敲除载体插入染色体的宿主细胞，然后利用木糖筛选二次重组的宿主细胞，筛选获得敲除D-丙氨酸消旋酶且不含有抗生素基因的宿主细胞。

12.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于，所述抗生素为红霉素。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶的信号肽为褐藻胶裂解酶信号肽98sp、yuiC信号肽或pel信号肽中的任意一种或至少两种的组合。

14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶基因启动子为HpaII启动子。

15.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌。

16.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求3-9任一项所述的表达载体。