[发明专利]多重PCR检测柯萨奇病毒、肠道病毒71型和肠道病毒通用型用引物探针组

权利要求书

1.多重PCR检测柯萨奇病毒A6型/A10型/A16型/肠道病毒71型/肠道病毒通用型用引物探针组，其特征在于，包括组分A和组分B，

其中，所述组分A包括：

SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的柯萨奇病毒A6型上游引物，

SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的柯萨奇病毒A6型下游引物，

具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的柯萨奇病毒A6型探针，所述柯萨奇病毒A6型探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；

SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的柯萨奇病毒A10型上游引物，

SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的柯萨奇病毒A10型下游引物，

具有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的柯萨奇病毒A10型探针，所述柯萨奇病毒A10型探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；

SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的柯萨奇病毒A16型上游引物，

SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的柯萨奇病毒A16型下游引物，

具有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的柯萨奇病毒A16型探针，所述柯萨奇病毒A16型探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；

所述组分B包括：

SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的肠道病毒71型上游引物，

SEQ ID NO.11所示核苷酸序列的肠道病毒71型下游引物，

具有SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的肠道病毒71型探针，所述肠道病毒71型探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；

SEQ ID NO.13所示核苷酸序列的肠道病毒通用型上游引物，

SEQ ID NO.14所示核苷酸序列的肠道病毒通用型下游引物，

具有SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的肠道病毒通用型探针，所述肠道病毒通用型探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。

2.根据权利要求1所述引物探针组，其中，所述组分A和组分B中还分别含有阳性内质控引物探针，

阳性内质控上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，

阳性内质控下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，

阳性内质控探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述阳性内质控探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。

3.一种多重荧光定量PCR检测柯萨奇病毒A6型/A10型/A16型/肠道病毒71型/肠道病毒通用型的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总核酸；

(2)以所述总核酸为PCR模板，利用权利要求1或2所述的引物探针组对所述PCR模板进行多重荧光定量PCR扩增；

其中，所述多重荧光定量PCR同时在两个体系中进行，

在第一个体系中，利用所述组分A对所述PCR模板进行第一扩增，

在第二个体系中，利用所述组分B对所述PCR模板进行第二扩增；

(3)分别收集第一个体系中FAM、VIC、CY5和ROX荧光通道信号，收集第二个体系中VIC、FAM和ROX荧光通道信号。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，所述检测方法还包括分别在两个体系中添加阳性内质控pET28a质粒模板。

5.根据权利要求3或4所述的检测方法，其中，所述引物探针组中，每条引物的最终使用浓度各自为0.3-0.6μM，每条探针的最终使用浓度各自为0.1-0.3μM。