[发明专利]鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记、引物及该引物用途

说明书

本发明涉及一种鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记、引物及该引物用途。标记包括用于检测野生型位点的标记Cas‑Osrr22‑1，还包括用于检测突变体WDR58‑cas‑1位点的标记Cas‑Osrr22‑2。本发明中的标记、引物及该引物用途较现有水稻育种技术可用于区分WDR58‑cas‑1突变体与野生型的分子标记，应用于水稻耐盐性状改良的辅助育种，可以在杂交育种、回交分离群体等进行鉴定，准确的区分杂合和纯和基因型，提高育种效率等。

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种能够用于鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记、引物及该引物用途。

背景技术

水稻(Oryza sativa L．)是世界上最重要的粮食作物之一，是全球三分之一人口的主要口粮，水稻产量是否供给充足直接影响全球粮食安全。而盐碱胁迫是制约水稻生产的主要非生物胁迫因素之一。

关于盐碱胁迫，一方面，还有较大面积的盐碱地无法种植水稻，另一方面，我们面临的环境日益恶化，土地盐碱化逐年加剧，全球受盐侵害的稻田约占栽培面积的20%，提高水稻耐盐性已成为育种家的重要目标之一。截至目前，已经克隆的耐盐相关的基因有：SKC1, DST, OsRR22,HAL2, P5CS, CMO, BADH, mtlD, gutD和SAMDC等。其中，OsRR22是一个负调控基因，编码一个696个氨基酸的B型反应调节蛋白转录因子，参与细胞分裂素信号转导和代谢，它的功能缺失显著提高了耐盐性。

CRISPR/Cas是一种在细菌和古细菌中发现的获得性免疫防御系统，目前已发现的CRISPR/Cas系统包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中Ⅱ型系统的组成较简单，由其改造成的CRISPR/Cas9技术以其易操作、低成本、高效率、高特异性和多重基因编辑等优势迅速成为了植物基因组精确编辑最为有效的工具，广泛地应用于动物、植物、微生物等基因功能和遗传改良研究。利用CRISPR/Cas9技术定点敲除不利基因或者负调控基因，快速敲除控制不良性状的基因簇从而实现目标性状的精准改良，将会大大提高作物定向遗传改良效率。

CAPs(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites)技术又可称为PCR-RFLP，限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术。所用的PCR引物是针对特定的位点而设计的。其基本步骤是：先进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物用限制性内切酶酶切，再用琼脂糖凝胶电泳检测观察多态性。

申请人日前增对自选育粳稻品种WDR58（其为秀水123///秀水123//秀水123/75-1-127，即将75-1-127与秀水123杂交，再将其后代与秀水123回交两次再自交5代所得的稳定品系），通过CRISPR/Cas9技术定点编辑水稻耐盐基因OsRR22，获得一个耐盐性显著提高的Osrr22基因功能缺失纯和突变体WDR58-cas-1。为提高WDR58-cas-1突变体在耐盐育种中的利用效率，如何开发一种用于区分WDR58-cas-1突变体与野生型的分子标记，以实现耐盐基因Osrr22突变体基因型的高效鉴定，在后续利用WDR58-cas-1突变体进行耐盐育种中具有重要价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种用于鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记、引物及该引物用途。

本发明为解决上述技术问题提出的技术方案（一）是：一种鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记，其特征在于：包括用于检测野生型位点的标记Cas-Osrr22-1，所述标记Cas-Osrr22-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2、所述的鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS 标记，其特征在于：所述突变体为WDR58-cas-1，所述标记还包括用于检测突变体WDR58- cas-1位点的标记Cas-Osrr22-2，所述标记Cas-Osrr22-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所 示。