[发明专利]鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记、引物及该引物用途

权利要求书

1.一种用于鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记的引物在水稻耐盐辅助育种中的应用，包括如下步骤：

i、提取供试水稻样品基因组DNA；

ii、利用所述引物CAPS-TailⅠ-F和CAPS-TailⅠ-R对步骤i中得到DNA进行PCR扩增；

iii、将步骤ii中得到的扩增产物经过限制性内切酶TailⅠ酶切，并对酶切产物进行分析，如果所述扩增产物能够切成255bp和400bp的特征条带，所述样品为OsRR22基因突变纯合体；

如果所述扩增产物不能酶切，只含有654bp的特征条带，所述样品为野生型；

如果所述酶切产物同时存在654bp、255bp和400bp的特征条带，则所述样品为Osrr22基因突变杂合体；

所述步骤ii中，PCR扩增的扩增体系为：20ng水稻基因组DNA模板，10uLTaqPCRMastermix，10uM的前后引物各1uL，补充ddH₂O至20uL；PCR扩增程序为：95℃预变性5min，然后按95℃30s，55℃下30s，72℃45s进行30个循环，最后72℃下延伸5min；

所述步骤iii中，酶切的反应体系为：2uL10×FastDigestBuffer，1uLFastDigest TailⅠ，10uLPCR产物，补充ddH₂O至30uL，反应条件65℃反应5min；之后进行琼脂糖凝胶电泳检测；

所述用于鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记的引物序列如下：

上游引物CAPS-TailⅠF：5’-CTTGGGATTGCTCTGTTTCT-3’

下游引物CAPS-TailⅠR：5’-GTAATAGCCTGGTTGGTTGAT-3’；

所述鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型特异性位点的CAPS标记为Cas-Osrr22-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述鉴别水稻耐盐基因OsRR22突变体WDR58-cas-1位点的标记为Cas-Osrr22-2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述水稻耐盐基因OsRR22突变体用sgRNA进行构建；

所述sgRNA序列为AGAGGGATCAATTCCCCGT；

所述用于鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记的引物应用于水稻耐盐辅助育种。