[发明专利]一种筛选微生物高多态性分子标记位点的方法

说明书

本发明公开了一种筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，将不同微生物的小种等量均匀混合后提取总核酸；构建高通量测序文库；寻找基因组上的变异位点；通过滑动平移筛选高多态性位点；在候选位点两侧设计多重扩增引物；对多重引物的筛选后即获得新的高多态性分子标记位点。理论上本发明可以一次性筛选出基因组上所有可用的高多态性分子标记位点，并且可以直接用于品种的高通量检测，不需要传统筛选方法中的反复验证过程；在应用上本方法所筛选出的分子标记位点可以批量检测，不需要对每个分子标记位点一个一个的做分子扩增和检测，因而加快了检测速度，并提高了准确性；本发明筛选出的分子标记多态性高、分辨率好，且筛选过程简单、快速且流程规范。

技术领域

本发明公开了一种筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，属于生物技术领域。

背景技术

分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段，分子标记技术广泛应用于基因定位、遗传图谱分析、法医以及新品种的审定等领域，具有广泛的应用价值和理论研究意义。但是由于受到现有分子标记的开发方法的限制，目前可用的分子标记数量都非常少，甚至某些物种缺乏可用的分子标记位点。在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：16S rDNA只能区分到种，无法在小种的水平上做区分；传统高多态性分子标记的开发多是依赖于研究者的个人经验，通过大量验证试验来获得，其过程耗费巨大、周期漫长，且不一定能获得真正高多态性的标记位点。而且整个开发过程一次只能找出一个高多态性的分子标记位点，而对于基因组上存在的众多其它潜在的高多态性分子标记位点则无能为力。传统的高多态性分子标记在应用中多是一个标记一个标记的检测，无法大规模、高通量的检测多个分子标记位点。部分物种目前有丰富的变异位点信息，但是却不一定会适用于所有的品种。因而批量寻找合适的分子标记位点是目前分子标记的研究和应用的最大障碍。

发明内容

针对现有技术中的上述缺陷，本发明的主要目的在于提供一种筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，可以一次性筛选出基因组上所有可用的高多态性分子标记位点，实现批量筛选，批量检测。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，包括如下步骤：

将不同品种的微生物小种等量混合后抽提总核酸，构建高通量测序文库；

采用高通量测序的方法对所述高通量测序文库进行高覆盖度的测序，获得测序片段；并将测序结果比对到所述小种的参考基因组上；根据比对结果获取所有的突变位点；

按照窗口平移获得每个窗口的突变位点的组合数，并将每种组合的测序片段数量换算成所述窗口上所有测序片断的百分比；计算每个窗口的多态性，并评估该窗口是否处于单拷贝区域，得到候选位点；

寻找候选位点两侧的保守区域，在所述保守区域设计分子标记的多重扩增引物；

对所述多重扩增引物筛选，获得新的高多态性分子标记位点。

作为进一步的优选，所述微生物小种数量大于5个，过少的小种数量将影响分子标记的多态性的评估。

作为进一步的优选，所述等量混合为：品种之间的基因组摩尔数比例为(0.9-1):(1-1.2)，构建高通量测序文库时不同小种间均匀混合。

作为进一步的优选，所述高覆盖度的测序包括：获得可覆盖基因组的核酸测序片段，且所述测序片段数量高于子类的数量。

作为进一步的优选，所述将测序结果比对到所述检测物种的参考基因组上，包括：以测序片段为单位展开，标记出每条测序片段上与参考基因组不同的每个碱基位点及其突变类型；把具有相同突变碱基位点和突变类型的reads定义为所述窗口内的一个基因型，获得所述窗口的所有候选基因型；为保证得到的变异位点是准确、可信的，我们忽略掉所有的插入、缺失变异，以及简单重复区的变异位点。