[发明专利]一种筛选微生物高多态性分子标记位点的方法

权利要求书

1.一种筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）将不同品种的微生物小种等量混合后抽提总核酸，构建高通量测序文库；

2）采用高通量测序的方法对所述高通量测序文库进行高覆盖度的测序，获得测序片段；并将测序结果比对到所述小种的参考基因组上；根据比对结果获取所有的突变位点；

3）按照窗口平移获得每个窗口的突变位点的组合数，并将每种组合的测序片段数量换算成所述窗口上所有测序片段的百分比；计算每个窗口的多态性，并评估该窗口是否处于单拷贝区域，得到候选位点；

4）寻找候选位点两侧的保守区域，在所述保守区域设计分子标记的多重扩增引物；

5）对所述多重扩增引物筛选，获得新的高多态性分子标记位点；

所述步骤2）中，将测序结果比对到所述小种的参考基因组上，包括：以测序片段为单位展开，标记出每条测序片段上与参考基因组不同的每个碱基位点及其突变类型；把具有相同突变碱基位点和突变类型的reads定义为所述窗口内的一个基因型，获得所述窗口的所有候选基因型；其中，忽略掉所有的插入、缺失变异，以及简单重复区的变异位点；

所述步骤3）中，计算每个窗口的多态性，包括：窗口长度设为L；统计每类基因型的测序片段数量，并除以完整覆盖所述窗口的测序片段的总数量，获得所述基因型的频率P；根据P计算该窗口的多态性指数D，公式如下：，其中p_i为该窗口第i个基因型的频率；根据多态性指数计算公式的计算结果，舍弃D值0.2的候选窗口；

所述步骤4）中，在保守区域设计分子标记的多重扩增引物，保守区域为：对于长度为L的一个滑动窗口，窗口在基因组上的起始位置设为S，该窗口终止位置为E，则窗口左侧保守区定义为坐标位置小于S、在测序数据中以及已有的数据中均未发现变异的连续n个碱基位点，窗口右侧保守区定义为坐标位置大于E、在测序数据中以及已有的知识中均未发现变异的连续n个碱基位点。

2.根据权利要求1所述的筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，其特征在于：所述步骤1）中，微生物小种数量大于5个。

3.根据权利要求1所述的筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，其特征在于：所述步骤4）中，在所述保守区域内设计的引物3’末端不含有低复杂序列。