[发明专利]一种检测脊肌萎缩症相关的基因突变的方法

说明书

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体而言，涉及一种检测脊肌萎缩症相关的基因突变的方法。

背景技术

脊肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)是最常见的常染色体隐性遗传性神经肌肉病，发病率约为1/6000～1/10,000[1]。该病是由于运动神经元存活基因1(survival motor neuron,SMN1)纯合缺失或复合杂合突变(杂合缺失伴点突变)所致。基因诊断是SMA疾病临床确诊的主要依据。然而，目前SMA基因诊断主要针对SMN1基因纯合缺失患儿，仍有很大比例的点突变患儿尚未得到明确的基因诊断[2-5]。

SMN1基因全长27Kb，包含9个外显子(1，2a，2b，3～8)，该基因存在与其高度同源的 SMN2基因，前者为SMA疾病的致病基因，后者则为疾病表型的修饰基因[6-8]。上述两个基因在全部基因组上仅存在5个核苷酸差异位点，其中2个位点位于外显子区(E7和E8各一个)。在SMA的实际临床基因诊断过程中，鉴于两个基因高度同源，直接基于基因组水平进行扩增测序来明确点突变来源是SMN1或SMN2较为困难。目前，国内外大多数SMN1点突变基因诊断是基于cDNA水平，利用RT-克隆技术结合测序分析鉴别点突变是否发生于SMN1基因 [9-14]。

申请人近年来一直致力于SMN1基因点突变的研究，先后确定SMN1点突变15种，发现除了常见的错义突变和移码突变外，产生提前终止密码子(Premature termination codon,PTC) 的SMN1点突变也有6种，约占SMA点突变人群的70％(36/50)，其中，p.Ser8Lysfs*23、 p.Leu228*为中国SMA的常见突变[5-8]。

而多项研究表明，含有PTC的转录产物,将导致翻译提前终止而产生无生物活性甚至毒害性截短蛋白。而无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)作用机制是机体内的一种翻译依赖性质控机制，可选择性地迅速降解含有PTC的mRNA(PTC+mRNA)，避免产生对细胞正常生理功能有害的截短蛋白。

申请人发现相比错义突变(p.Arg2Gly)，上述携带PTC的突变在RT-克隆实验中全长SMN1 基因mRNA转录本的阳性克隆比例极低，降低了点突变基因诊断效率，为临床基因确诊带来了很大困难，有必要对点突变的临床基因诊断策略进行优化。对携带上述突变的患儿外周血进行全长SMN1基因转录本的检测，结果提示其SMN1mRNA转录水平显著下降[10,13]。这提示我们，SMN1基因无义/移码突变极可能通过NMD机制下调含PTC的全长SMN1mRNA转录，进而引起含全长转录本的阳性克隆比例降低，这就是造成这类点突变基因诊断困难的根本原因。

Noensie和Diet最早将NMD应用于肿瘤研究，他们提出了一种新的研究策略，即通过抑制NMD来鉴定突变基因(gene identification by NMD inhibition,GINI),首先用药物或者siRNA来抑制NMD，然后通过微阵列技术比较基因表达状况的改变，表达上调的基因即可能为发生无义突变的抑癌基因[15]。这一研究策略也提示我们，在SMA无义/移码突变的基因诊断过程中，通过加入常用的抑制NMD机制的药物(如放线菌酮和嘌呤霉素)或使用RNAi的技术特异性的抑制相关NMD基因，可能会在一定程度上增加PTC+型mRNA的稳定性，提高含 PTC的全长SMN1转录本的表达，使得NMD相关突变的基因诊断中全长SMN1转录本阳性克隆比例上调，进而提高这类点突变基因诊断的效率，以达到优化SMN1点突变临床基因诊断策略的目的。

本发明拟在前期研究基础上，以SMN1基因常见突变p.Ser8Lysfs*23和p.Leu228*为研究对象，利用NMD药物抑制试验和NMD关键因子(UPF1)敲减实验明确其SMN1mRNA降解是否通过NMD调控所致；同时，将抑制NMD机制的药物应用于此类SMA点突变患儿的临床基因诊断中，观察其对SMA点突变诊断效率的影响，进而优化SMN1基因点突变的基因诊断策略。

发明内容

本发明首先提供一种SMN1基因突变的检测方法，所述方法包括如下步骤：

(1)用抑制无义介导的mRNA降解机制(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)的药物，或用抑制无义介导的mRNA降解机制(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)的干扰RNA处理来源于待测患者的细胞；

(2)提取处理后的目标细胞中的总RNA；