[发明专利]一种酿酒酵母乙醇耐受性的评价方法

说明书

本发明涉及一种酿酒酵母乙醇耐受性的评价方法，该方法包括以下步骤：⑴收集对数生长期的酿酒酵母悬浮液均分后离心，得到菌体沉淀A、B；⑵菌体沉淀A和B分别清洗后再次离心，得到清洗后的菌体沉淀A、B；⑶在清洗后的菌体沉淀A中加无菌水，经振荡处理、稀释，并测定600nm处OD值，记为OD_x；⑷在清洗后的菌体沉淀B中加乙醇水溶液，经振荡处理并测定600nm处OD值，记为OD_e；⑸乙醇水溶液处理的酵母菌液接种到YPD培养基中，经振荡培养后测定OD值，记为OD_p；⑹稀释后的酵母菌液接种到YPD培养基中，经振荡培养后测定OD值，记为OD_y；⑺以OD_x为横坐标，OD_y为纵坐标，拟合得到y=ax+b的公式；⑻OD_p代入y=ax+b后，得x值；⑼将x/OD_e的值定义为耐受值。本发明操作简单、适用范围广。

技术领域

本发明涉及微生物对代谢产物耐受性的研究领域，尤其涉及一种酿酒酵母乙醇耐受性的评价方法。

背景技术

生物质能是重要的可再生能源，具有绿色、低碳、清洁、可再生等特点。加快生物质能开发，利用甜高粱茎秆、薯类作物等非粮生物质为原料生产燃料乙醇，是推进能源生产和消费革命的重要内容，是改善环境质量、发展循环经济的重要任务。发酵糖浓度一般在16~23%（w/v）左右，发酵完毕后的醪液中乙醇浓度在8~12%左右（v/v），发酵液中，乙醇浓度低导致精馏能耗高，废糟液量大，所以提高发酵终点乙醇浓度对降低蒸馏能耗，减少废糟液处理能耗，保护环境，提高企业经济效益具有重要的现实意义。但是，乙醇浓度升高会对发酵过程中酵母细胞的生长产生胁迫作用，抑制酵母细胞生长、存活及发酵能力，酵母细胞为了生存、生长会产生相应的应激反应来应对这种胁迫，这种应对机制即酵母对乙醇产生了耐受性。所以，在生产过程中，建立一种酿酒酵母乙醇耐受性的评价方法，可为高耐受及高产酿酒酵母的选育提供便捷，也可为研究微生物抵御不良环境的生理机制提供技术方法。

目前，高浓度乙醇冲击下酵母细胞的存活率被广泛用于评价酵母的乙醇耐受性以及反映了营养条件和培养环境对耐受性的影响。基于该方法，酵母经高浓度乙醇冲击后，存活率的计算一般采用：酵母菌液稀释不同倍数涂布平板计数或者美兰染色后在显微镜下计数两种方法。但是这两种方法容易受到操作过程影响，酵母在平板上生长较慢、容易染菌，存在涂布不均匀无法计数的问题，并且涂布平板数量足够多才具有统计意义；美兰染色法只适用于死、活酵母细胞的区分，对于处于休眠状态的酵母无法通过染色判断死活，存在计数误差。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、适用范围广的酿酒酵母乙醇耐受性的评价方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种酿酒酵母乙醇耐受性的评价方法，包括以下步骤：

⑴收集对数生长期的酿酒酵母悬浮液40mL，均分到两个50mL的离心管中离心，分别得到菌体沉淀A、菌体沉淀B；

⑵所述菌体沉淀A和所述菌体沉淀B分别采用20~40mL无菌水清洗后再次离心，得到清洗后的菌体沉淀A、清洗后的菌体沉淀B；

⑶在所述清洗后的菌体沉淀A中加入20~40mL无菌水，混合均匀后倒入50mL无菌锥形瓶A，经振荡处理得到无菌水处理的酵母菌液；该无菌水处理的酵母菌液采用无菌水分别稀释成20%、40%、60%、80%、100%体积浓度的酵母菌液，并测定600nm处OD值，记为OD_x；

⑷在所述清洗后的菌体沉淀B中加入20~40mL体积浓度为8~18%的乙醇水溶液，混合均匀后倒入50mL无菌锥形瓶B，经振荡处理得到乙醇水溶液处理的酵母菌液，并测定600nm处该乙醇水溶液处理的酵母菌液OD值，记为OD_e；

⑸将200~1000μL所述乙醇水溶液处理的酵母菌液接种到20mL YPD培养基中，经振荡培养后测定OD值，记为OD_p；