[发明专利]一种蛋白质化学交联剂及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种蛋白质化学交联剂，其结构如通式I所示；本发明同时涉及所述蛋白质化学交联剂的制备方法。本发明提供的多功能交联剂交联效率和稳定性都很好，尤其是基于三甲基硅基重氮甲基功能团类型的交联剂，对天冬氨酸和谷氨酸的侧链羧基以及蛋白质的碳端羧基的交联效率很高，是首例无需加入缩合剂活化的基于含有羧基的氨基酸残基选择性的交联剂。本发明通过对N‑(Boc)谷氨酸甲酯以及对含多种氨基酸的多肽的交联反应证明所述交联剂了对含有羧酸氨基酸残基有很高的交联效率及选择性，其与九种模式蛋白质和一种含有八种蛋白的混合物的交联反应证明了该类交联剂与含有羧基的氨基酸残基的简单纯蛋白体以及复杂的蛋白体系都具有很高的交联效率。R1‑X‑R2‑‑I。

技术领域

本发明涉及蛋白质的结构及功能研究领域，具体涉及一种蛋白质化学交联剂交联应用及其制备方法。

背景技术

随着人类基因组计划的完成，仅完成基因层面的研究对于深入了解生物体各项生理功能及机制还远远不够。蛋白质作为生命体的物质基础和生命活动的主要承担者，在过去十几年被发现的数量大幅增加，研究其功能对理解各项生命活动的本质意义重大。目前，人们对于大量新发现的蛋白质的功能及其作用机制仍然不清楚，而蛋白质功能研究的本质就是解析其三维结构以及与其相互作用的蛋白。传统的蛋白质结构解析的方法主要包括：X射线晶体衍射法和核磁共振光谱学。这两种方法的分辨率都可以达到原子水平，但是对于蛋白样品量及纯度要求较高。对于X射线晶体衍射法而言，必须有蛋白晶体使其局限性较高，对于一些分子量大的蛋白质或蛋白质复合体的晶体是非常难获得的，此类蛋白用该方法无法实现结构解析；而核磁共振光谱学则对蛋白质有的水溶性有较高要求，且一般蛋白分子量要小于30kDa。化学交联蛋白结合质谱鉴定技术是近些年发展起来的一种高效方法，该方法则克服了上述问题。其原理主要通过用化学交联剂(chemical cross-linker)在相互作用的蛋白表面之间选择性与某些类型的氨基酸残基共价连接，再通过质谱鉴定交联的氨基酸位点获得蛋白结构信息。该方法整个工作流程包括(如图1所示)：1)交联剂特异性与蛋白质上某种氨基酸发生交联反应；2)被交联的蛋白样品通过酶切处理成肽段；3)串联质谱分析鉴定酶切后的交联肽段，进一步分析鉴定蛋白结构信息。此外，还有一种新兴的单分子冷冻电镜－三维重构技术目前备受结构生物学关注及应用，但其不能满足分子量大的蛋白质或蛋白复合体的局部构象解析的要求，所以常被用于与化学交联蛋白结合质谱鉴定技术联合使用于蛋白结构解析。化学交联剂常分为两种：分体式交联剂与一体式交联剂，他们的结构示意图如图2所示。

质谱技术的快速发展推动了化学交联剂对蛋白与蛋白的相互作用的研究应用。这主要归功于化学交联蛋白结合质谱鉴定技术的一些独特优势：1)化学交联剂可通过不可逆的共价键连接相互作用的蛋白质，理论上可以捕获到瞬时的以及动态的蛋白相互作用，而这运用其它方法很难实现；2)由于质谱分析是在蛋白质被水解后的多肽水平，因此该方法不受蛋白质纯度或蛋白复合物分子大小的限制；3)该方法分析速度快，对样品纯度要求低，灵敏度很高，需要的蛋白量可低至微克级别；4)有很多种可供选择的不同性质的化学交联剂，根据两个反应官能团的差别可分为：氨基—氨基，氨基—巯基，巯基—巯基，巯基—羧基；同时两个反应官能团之间的臂长也可以改变。

目前，已经有不少的基于赖氨酸和半胱氨酸等残基选择性的化学方法被发展用于蛋白交联。而发展更多方法来交联其他氨基酸对于研究蛋白-蛋白相互作用及蛋白复合物结构解析的意义重大，特别是对于那些蛋白相互作用表面丰度较高的氨基酸的交联对研究蛋白相互作用尤为重要。根据最新的数据库统计显示，含有羧酸的氨基酸残基占氨基酸总量的12.2％(天冬氨酸5.5％和谷氨酸6.7％)，与已被广泛发展交联的基于赖氨酸(5.8％)的方法相比，发展高效的交联羧基的方法意义尤为重大。但由于羧基本身活性较低，一般需要加入缩合剂活化，目前基于羧基的交联剂也很少，尤其是无需缩合剂活化的交联剂还无任何报道。