[发明专利]梨果实不同发育时期荧光定量内参基因的筛选及应用

说明书

本发明公开了梨果实不同发育时期荧光定量内参基因的筛选及应用，本发明涉及梨分子生物学研究领域。根据多个品种梨果实动态RNA‑Seq测序结果、后期实验验证及数据分析，针对性的获得了在翠冠、丰水和雪青梨果实不同发育时期中比常用的管家基因更为稳定的内参基因，最大程度地减小了由于内参基因的选择造成样品之间和样品内部的差异，能够实现对目标基因表达水平的校正和标准化，以达到对梨果实功能基因表达的精确定量。

技术领域

本发明涉及分子生物学研究领域，具体涉及梨果实发育过程中实时荧光定量PCR内参基 因的筛选及其应用。

背景技术

梨(Pyrus)是我国的主栽果树之一，栽培历史悠久，栽培区域涵盖全国各地，栽培面积 和产量一直居世界首位。近年来，我国科研工作者围绕梨从分子生物学层面开展了众多研 究，尤其2012年5月世界首个梨全基因组测序、组装和基因注释工作完成后，基因表达分 析已经广泛应用于揭示梨果实基因调控机理的研究中。

实时荧光定量PCR具有灵敏度高、重复性好、特异性强和高通量等特点，目前广泛地应 用于农学、医学、微生物学等众多研究领域。然而，RNA的质量和产量、反转录效率的差异等因素都会对目的基因表达分析结果的准确性产生影响，因此要精确判断特定靶基因表达 的水平，需要选择合适的内参基因对目标基因的表达水平进行校正和标准化，减小检测样本 本身对定量结果的影响。这也进一步说明合适的内参基因是精确分析qRT-PCR结果的重要 前提，筛选稳定的内参基因在基因表达分析中起着关键的作用。

理想的内参基因应该是不受生长阶段，组织器官，以及实验处理条件的影响。然而，大 量的研究结果表明，并没有这样理想的稳定基因。梨树中常用的传统看家基因有肌动蛋白基 因Actin、微管蛋白基因β-Tubulin、转录延伸因子基因EF-1α、多聚泛素蛋白基因Ubiquitin 等，这些基因表达较为稳定，本身拷贝数高，在不同器官、组织或者细胞中组成型表达，具 有相当的保守性，表达水平能够保持一致。但是越来越多的报道指出，在不同的生长阶段或 者实验条件下，传统的管家基因作为内参基因荧光定量PCR的结果迥异，并不能够稳定表 达，有时会导致结论相反，不能真实的反映出基因的表达水平。随着RNA-Seq技术的快速 发展，根据实验目的和组织器官，筛选鉴定开发出新的稳定表达的内参基因是解决传统看家 基因弊端的有效途径。

本发明基于RNA-Seq比较基因表达差异以筛选梨果实发育相关基因的研究过程，从中挖 掘表达量较高并且表达稳定的基因作为梨果实候选内参基因，并通过具体的试验验证，以及 利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和ReFinder 4种软件从不同统计学角度分析验 证候选内参基因在果实的整个发育阶段中的表达稳定性。本发明成功发现了梨果实发育过程 中稳定的内参基因，并对后期通过qRT-PCR探索梨果实关键基因奠定了坚实的基础。

发明内容

1、要解决的技术问题

为梨果实发育过程中相关基因表达分析提供更可靠的内参基因，以克服上述背景技术中 传统看家基因的缺点和不足，更精确的验证基因表达水平，为挖掘梨果实发育中的有意义的 基因奠定基础。

2、技术方案

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

梨果实不同发育时期荧光定量内参基因，包含以下(1)～(3)中的至少一种：

(1)翠冠梨果实不同发育时期荧光定量内参基因为Pbr028511，该内参基因Pbr028511 的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)丰水梨果实不同发育时期荧光定量内参基因为Pbr038418，该内参基因Pbr038418 的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

(3)雪青梨果实不同发育时期荧光定量内参基因为Pbr041114，该内参基因Pbr041114 的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。