[发明专利]乳制品中粘红酵母的检测探针、基因芯片和方法

权利要求书

1.一种乳制品中粘红酵母的检测探针，其特征在于：包括：

粘红酵母ITS的检测探针：

5’NH₃—TTTTTTTTTTTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCC—3’；

粘红酵母tubB的检测探针：

5’NH₃—TTTTTTTTTTTTCAGCGTGTCGCACGCCTCGGTCTCGTG—3’。

2.一种乳制品中粘红酵母的检测基因芯片，其特征在于：包括权利要求1所述的检测探针。

3.一种乳制品中粘红酵母的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）、靶序列的确定：

真菌粘红酵母的特异性检测靶序列分别为：

粘红酵母ITS：

AAGGATCATTAGTGAATCTAGGACGTCCAACTTAACTTGGAGTCCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCATCTGTTAATTGGACTAGTAGCTCTTCGGAGTGAACCGCCATTCACTTATAAACACAAAGTCTATGAATGTATACAAATTTATAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTTCAACCCACCTCTTTCTTAGTGAATCTGGTGGTGCTTGGTTTCTGAGCGCTGCTCTGCTTCGGCTTAGCTCGTTCGTAATGCATTAGCATCCGCAACCGAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCTGAGGATTCTAGTTTACTAGAGCCGAGTTGGGTTAAAGGAAGCTCCTAATCCTAAAGTCTATTTTTTTGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAA

粘红酵母tubB：

GGCGCCGAGCTCGTCGACTCGATCCTCGACCAGCTGCACCACGAGACCGAGGCGTGCGACACGCTGCAGGGCTTCCAGATGGTGCACTCGGTCGGCGGCGGGACCGGGTCGGAGCTCGGGACGCTCATCCTCAGCAAGATCCGCGAGGAGGTGCGTCTCTGCGGCTCTCTCTCGCTTATCTCTCTGCTGTTCCCCGTCGATGGTCGATCGGTGACGCTCTAGCACTCGCCTGCAGTTCCCCGACCGCATGCTCGCGACCTACTCGGGTGTGCCGTCGCCCAAGGTGTGCGAGACCGTCGTCGAGCCGTACACAGCCATCCTGTCGTACCACCAGCTCATCGAGAACCGCGACATGGTCTTTGCGTTCGACAACGAGGCGCTGTACGACATCATGGCGCGCACCGTCAAGGTGTCAAACCCGGCGTACGCGCAGCTCAACGGCCTCATCACAAAGGTCATGAGCGGCATCACGACGCCGTTGCGGTTCCCGGGCCAGCTCAACTC；

（2）、引物与探针的设计：

靶序列确定后，根据引物与探针设计原则，设计引物与探针如下：

粘红酵母ITS：

引物1：5’ cy3—AAGGATCATTAGTGAATCTAGG—3’

引物2：5’—GTTCAGCGGGTAGTCCTACCTG—3’

检测探针：

5’NH₃—TTTTTTTTTTTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCC—3’；

粘红酵母tubB：

引物1：5’ cy3—GGCGCCGAGCTCGTCGACTCG—3’

引物2：5’—GAGTTGAGCTGGCCCGGGAAC—3’

检测探针：

5’NH₃—TTTTTTTTTTTTCAGCGTGTCGCACGCCTCGGTCTCGTG—3’；

（3）、模板提取：将乳品置于-80℃速冻15min，取出后置于研磨中，在液氮环境下将其整体研磨成粉末状，用CTAB方法提取粉末中的核酸；

（4）、RT-PCR扩增及荧光标记：

用已经荧光标记的引物对步骤（3）所提取的模板进行RT-PCR扩增；

（5）、芯片制备：

将氨基化的探针点在醛基片基上，室温放置过夜，先后用洗脱液I、洗脱液II洗脱，将没有固定上的探针洗脱掉，然后离心甩干备用；

（6）、分子杂交：将步骤（4）的PCR产物与步骤（5）制备好的芯片进行原位杂交，在42℃下保持40min，用洗脱液I、洗脱液II洗脱；

（7）、结果分析：用激光共聚焦扫描仪检测杂交结果。

4.根据权利要求3所述的乳制品中粘红酵母的检测方法，其特征在于：步骤（5）中，在片基上固定另外两种乳制品污染真菌罗伦氏隐球酵母、烟曲霉相关基因的检测探针，以作为阴性对照使用；

具体探针如下：

罗伦氏隐球酵母ITS的检测探针：

5’NH₃—TTTTTTTTTTTGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTG—3’；

罗伦氏隐球酵母rpb的检测探针：

5’NH₃—TTTTTTTTTTTTGCTTCAAACGATGTTGCGGCTTGATCTG—3’；

烟曲霉ITS的检测探针：

5’NH₃—TTTTTTTTTTGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAG—3’；

烟曲霉abr的检测探针：

5’NH₃—TTTTTTTTTTTTGCCACAGTGCACTATTCCCTCGACCTG—3’。