[发明专利]提高DNB双末端测序质量的方法和DNB双末端测序方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种提高DNB双末端测序质量的方法和DNB双末端测序方法和试剂盒。本发明的提高DNB双末端测序质量的方法，包括：对DNA纳米球进行一链合成测序时，使用部分dUTP代替dTTP进行联合探针锚定聚合测序；在所述一链合成测序完成后，使用USER酶消化一链上的尿嘧啶，然后使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链。本发明的方法能够实现完全去除一链的目的，降低一链对二链的负面影响，从而提高DNB双末端测序的读长和质量。

技术领域

本发明涉及测序技术领域，尤其涉及基于DNA纳米球(DNB)的基因测序技术领域，特别涉及一种提高DNB双末端测序质量的方法和DNB双末端测序方法和试剂盒。

背景技术

滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)是借鉴自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环复制方式而建立的一种恒温核酸扩增技术，美国Complete GenomicsInc.(简称CG)利用RCA技术开发了基于DNA纳米球(DNA nanoball,DNB)的基因测序平台，并将其商业化。2012年华大基因收购CG，开始利用CG专利技术研发新一代双末端测序技术，基于RCA原理的DNB技术再次取得重要突破，成为领域关注热点。

与其他二代测序技术相比较，DNB测序技术具有以下几个优势：DNB通过增加待测DNA的拷贝数而增强了信号强度，从而提高测序准确度；不同于PCR指数扩增，滚环扩增技术的扩增错误不会累积；DNB与芯片上活化位点的大小相同，每个位点只固定一个DNB，保证信号点之间不产生相互干扰；这些优势也将意味着DNB测序技术在未来测序方向有重要意义。

DNB双末端测序目前主要是基于多重置换扩增法，如图1所示，主要流程包括：基因组DNA首先经过片段化处理，再加上接头序列，并环化形成单链环状DNA，随后使用滚环扩增技术可将单链环状DNA扩增2-3个数量级，所产生的扩增产物称为DNA纳米球，最终DNA纳米球经过DNB装载技术固定在阵列化的硅芯片上，通过联合探针锚定聚合技术(cPAS)进行第一链(Forward Strand)测序，在具备链置换功能的高保真聚合酶的作用下，形成第二链(Reverse Strand)，并通过DNA分子锚，进行第二链的测序，具有合成快、准确度高等优点。

基于多重置换扩增法的DNB双末端测序，随着一链测序读长的增加，一链和模板链的结合能力大大增强，而且DNB本身结构等复杂因素，单纯利用高保真聚合酶很难把一链置换完成，无法直接用变性剂洗脱，对二链模板的合成有负面影响，从而影响了二链的测序读长和质量。

发明内容

本发明提供一种提高DNB双末端测序质量的方法和DNB双末端测序方法和试剂盒，本发明的方法利用USER酶能使尿嘧啶位置产生单核苷酸缺口的特性，在一链合成过程中引入部分dUTP，通过USER酶切割使得一链片段化，有效减少一链和模板链的结合能力，然后洗脱和消化一链以减小一链对二链测序质量的影响，有效提高DNB双末端测序数据质量和读长。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种提高DNB双末端测序质量的方法，包括：对DNA纳米球进行一链合成测序时，使用部分dUTP代替dTTP进行联合探针锚定聚合测序；在上述一链合成测序完成后，使用USER酶消化一链上的尿嘧啶，然后使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链。

进一步地，上述dUTP占dUTP和dTTP总量的1％～99％，优选50％～75％。

进一步地，上述dUTP占dUTP和dTTP总量的50％。

进一步地，上述变性剂是甲酰胺。