[发明专利]用于检测煤地质微生物细菌物种的DNA Marker及制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种煤地质环境微生物菌群的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分子检测中煤地质环境细菌专用的物种DNA Marker，属于微生物分子生态学领域。本发明用于检测煤地质微生物细菌物种的DNA Marker，该DNA Marker由11条DNA片段a‑k组成，DNA片段a的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，DNA片段b的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，DNA片段c的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，DNA片段d的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，DNA片段e的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，DNA片段f的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示，DNA片段g的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示，DNA片段h的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示，DNA片段i的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示，DNA片段j的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.10所示，DNA片段k的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示。

技术领域

本发明涉及一种煤地质环境微生物菌群的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分子检测中煤地质环境细菌专用的物种DNA Marker，属于微生物分子生态学领域。

背景技术

煤地质环境微生物是指煤层产出水样或煤样中检测到的微生物或上述两样经富集培养后检测到的微生物，主要分为细菌和古菌两大类。它们主要参与降解煤产甲烷的过程中。煤层气作为一种清洁能源，在世界上备受关注，根据成因不同，煤层气可分为热成因气和生物成因气。生物成因气又可分为原生生物成因气和次生生物成因气，原生生物成因气形成于煤化作用的早期阶段，难于大量保存，目前探测到的生物成因煤层气多为次生生物气，次生生物气是由产甲烷菌等厌氧菌(包括细菌及古菌等)代谢煤或煤层物质产生的以甲烷为主要成分的气体。目前，生物成因煤层气具体的生成过程及机理还不是十分清楚，唯一确定的是产甲烷的最后一步，它是由产甲烷古菌将CO₂+H₂、乙酸和一些甲基化物质转化为甲烷。国内外研究学者们在生物成因气的产气机理上形成了普遍的共识，即一些发酵细菌和产氢气产乙酸菌分解煤层有机质产生CO₂、H₂、乙酸等中间代谢产物，最后，产甲烷古菌可利用这些中间代谢产物作为能源、碳源产生甲烷。研究煤层气相关微生物多样性及其活性与功能对煤层气再生和揭示生物降解煤具有重要意义。目前研究发现，参与产气过程中的产甲烷古菌主要有Methanosarcina spp、Methanolobus、Methanobacterium等，发酵细菌及产氢气产乙酸菌主要有Bacteroidales、Firmicutes、Acetobacterium spp等。

在以往的几十年，国内外学者主要基于16S rRNA的未培微生物研究技术来分析煤层气相关微生物的多样性，常见于克隆文库、末端限制性片段长度多样性(Terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)、高通量测序、变性梯度凝胶电泳(Denatured Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)等分析。各项分析技术都有其特有的局限性。其中，克隆文库建库库容量有限，往往不能准确地反应原始样品中微生物的多样性。T-RFLP可能会对微生物的多样性造成过多估计，准确性较差。高通量测序虽然准确性高，但针对微生物多样性分析的周期较长，耗时又耗钱，成本较高。