[发明专利]用于检测煤地质微生物细菌物种的DNA Marker及制备方法和应用

权利要求书

1.用于检测煤地质微生物细菌物种的DNA Marker，其特征在于：该DNA Marker由11条DNA片段a-k组成，DNA片段a的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，DNA片段b的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，DNA片段c的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，DNA片段d的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，DNA片段e的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，DNA片段f的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示，DNA片段g的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示，DNA片段h的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示，DNA片段i的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示，DNA片段j的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.10所示，DNA片段k的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示。

2.权利要求1所述的用于检测煤地质微生物细菌物种的DNA Marker的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)提取高阶煤层产出水样的富集培养液基因组DNA，以提取的微生物基因组DNA为模板，第一次PCR扩增细菌16S rDNA V3区序列，将第一次PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，并回收目标DNA片段；

(2)以回收的目标DNA片段为模板进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物进行DGGE分析，从DGGE胶上切下的DNA片段为细菌16S rDNA V3区DNA片段；

(3)以步骤(2)DGGE胶上切下的细菌16S rDNA V3区DNA片段为模板经第三次PCR扩增，回收第三次PCR扩增产物；

(4)将步骤(3)的第三次PCR扩增产物克隆到T载体上获得连接产物；

(5)将经步骤(4)获得的连接产物转入宿主菌，筛选阳性重组子；

(6)以阳性重组子作为模板进行第四次PCR扩增；

(7)将步骤(6)第四次PCR扩增产物再次进行DGGE分析，验证条带位置，条带位置正确的DNA片段作为煤地质微生物细菌物种DNA Marker组成中的DNA片段a；

(8)重复步骤(1)至(7)，制备煤地质微生物细菌物种DNA Marker组成中的DNA片段b-k；

(9)步骤(7)和(8)的组合构成煤地质微生物细菌物种DNA Marker；

所述步骤(1)中第一次PCR扩增和步骤(3)中第三次PCR扩增时用到的引物为338f/518r；所述步骤(2)中第二次PCR扩增和步骤(6)中第四次PCR扩增时用到的引物为338f-GC/518r；

所述引物338f/518r和338f-GC/518r的序列为：

338f：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；

338f-GC：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG；

518r：ATTACCGCGGCTGCTGG。

3.根据权利要求2所述的用于检测煤地质微生物细菌物种的DNA Marker的制备方法，其特征在于步骤(6)中第四次PCR扩增中所使用的模板浓度为8～12ng/μL。

4.根据权利要求2所述的用于检测煤地质微生物细菌物种的DNA Marker的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的从DGGE胶上切下的DNA片段用30μL去离子水在4℃条件下浸泡过夜，取浸泡液作为步骤(3)的模板。

5.根据权利要求2所述的用于检测煤地质微生物细菌物种的DNA Marker的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中T载体为载体。

6.根据权利要求2所述的用于检测煤地质微生物细菌物种的DNA Marker的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中宿主菌为大肠杆菌DH5α。

7.权利要求1所述的用于检测煤地质微生物细菌物种的DNA Marker的应用，其特征是将物种DNA Marker与6×DNA上样缓冲液以体积比5：1混合，用于煤地质微生物PCR-DGGE细菌物种的检测。