[发明专利]检测异源cfDNA的SNP分子标记及检测方法、用途

说明书

本发明公开了一种检测异源cfDNA的SNP分子标记，基于SNP分子标记设计的检测探针和芯片，以及异源cfDNA的检测装置、试剂盒和检测方法；利用上述检测芯片和检测装置对肾移植后受体中异源cfDNA的定量，为检测肾移植排斥反应提供依据，实现了针对肾移植的高灵敏度和高特异性的无创早期检测，并可对肾移植患者进行持续性的监测；SNP分子标记中包括药物代谢基因的SNP位点，为肾移植排斥患者提供用药基因的突变信息，实现个体化用药；本发明还提供了一种单分子标记接头，单分子标记接头用于构建测序文库有效去除重复数据和测序、PCR过程中随机引入的错误，降低测序背景噪音，提高了检测的准确性。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种检测异源cfDNA的SNP分子标记及其探针、芯片、试剂盒、方法、检测装置和用途。

背景技术

肾移植是临床治疗终末期肾病的优选手段，而影响肾移植术后患者生存率的最重要原因为排斥反应的发生。移植排斥分为超急性、急性、边缘型急性、亚临床急性或慢性,急性排斥反应(acute rejection,AR)是目前肾移植术后的主要危险并发症，也是导致慢性排斥反应和移植肾失功的最重要的危险因素。早期诊断及时治疗AR可以有效减少移植器官的病理损害程度，延长移植器官的存活时间。

通常诊断发生急性排斥反应的指标有：患者临床表现、各项生化指标(丙氨酸氨基转移酶、总胆红素、碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转移酶、肌酐或心肌酶谱)和组织活检。前两项检测的灵敏度和特异性低，且检测结果依赖于临床医生的临床经验易产生偏差。

穿刺活检一直是肾移植排异反应检测的金标准，但组织活检花费大，属创伤性检查常伴随并发症，包括：疼痛、血尿、肾血肿、移植物血栓症、败血症、休克和移植物衰竭等。近年来诊断肾移植急性排斥反应的发生，一直朝向寻找非侵入性无创检测的方向努力。血清中肌酐水平的增高通常是诊断肾移植后排斥反应的一个有效指标，但肌酐检测具有非特异性，除了肾排斥反应，肾移植患者排异药物中毒引起的急性肾衰竭也会导致肌酐升高，因此，肌酐水平的监测不宜单独作为判断肾移植排斥反应的依据。目前，肾移植患者面临的主要临床问题之一就是缺少用于早期诊断和连续监控移植物排斥风险的高灵敏度、高特异性且非侵入性的检测。

游离DNA(cell free DNA,cfDNA)，是指游离于细胞外的部分降解了的机体内源DNA，主要来自于细胞的凋亡或坏死。异源或自体的体细胞突变DNA都可以在本体的血液中检测到，例如孕妇、肿瘤患者和器官移植患者。由于cfDNA的半衰期很短(16min)，cfDNA作为生物标志物的潜力巨大。Dennis Lo最早在女性肝、肾移植患者的血浆中检测到来自男性供体组织的游离DNA，被认为是供体器官在患者体内凋亡或坏死，细胞裂解释放出的cfDNA，游离DNA可以作为器官移植排异的标志物(参见Presence of donor-specific DNA inplasma of kidney and liver-transplant recipients.Lancet.1998May 2；351(9112):1329-30.)。正常状态下受体血液中供体来源的cfDNA几乎没有或者含量是极低的，通过检测器官移植受体中供体来源的cfDNA的比例，可用于判断器官移植后是否发生排斥反应。