[发明专利]检测DNA聚合酶活性的方法及检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种检测DNA聚合酶活性的方法及检测试剂盒。该方法将待测DNA聚合酶与足量的待补平模板混合，在dNTP存在的条件下，通过待测DNA聚合酶诱导待补平模板中的第一DNA片段延伸形成与凸出片段的碱基互补的补平片段得到补平模板。补平模板中的U碱基被足量的UDG酶消化去除，得到适于PCR扩增的模板，正向引物针对凸出片段设计，反向引物针对第一DNA片段的5’端设计，诱导第一模板链扩增。而未经补平的模板经消化酶去除U碱基后则无法与正向引物配对，即不能进行PCR扩增反应。将待测DNA聚合酶的CT值带入由DNA聚合酶标准品建立的标准曲线中，运算即可获得待测DNA聚合酶的酶活性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测DNA聚合酶活性的方法及检测试剂盒。

背景技术

DNA聚合酶(DNA polymerase)是细胞复制DNA中的重要作用酶，在特定的条件下能够诱导DNA链的复制延长。生物体内较为重要的DNA聚合酶例如有T4 DNA聚合酶、Klenow酶(又称Klenow片段，Klenow Fragment)和DNA聚合酶I(DNA-pol I)等。其中T4 DNA聚合酶是由T4噬菌体聚合酶I基因编码，具有5’-3’聚合酶活性以及3’-5’外切酶活性。T4 DNA聚合酶是基因工程技术中一种重要的工具酶，在高通量测序(next generation sequencing)文库构建的过程具有重要的作用。

传统的检测DNA聚合酶活性的方法一般采用放射性同位素法，将DNA聚合酶催化的32P标记的dNTP掺入到小牛胸腺DNA中。经过TCA沉淀、whatman滤纸过滤，通过测定酸不溶性物质中放射性的含量，从而计算聚合酶活性。这种方法易产生放射性污染、操作繁琐，难以实现高通量的检测。

发明内容

基于此，有必要提供一种非放射性、操作简便的检测DNA聚合酶活性的方法及检测试剂盒。

一种检测DNA聚合酶活性的方法，包括以下步骤：

提供待补平模板，所述待补平模板包括第一模板链和第二模板链，所述第一模板链包括第一DNA片段，所述第二模板链包括第二DNA片段以及与所述第二DNA片段5’端相连接的凸出片段，所述第二DNA片段与所述第一DNA片段碱基互补，所述凸出片段中含有U碱基；

在dNTP存在的条件下，将待测DNA聚合酶与足量的所述待补平模板混合，使得所述第一DNA片段的3’端延伸形成补平片段，得到补平模板，所述补平片段与所述凸出片段碱基互补；

将所述补平模板与正向引物、反向引物、探针、dNTP以及足量的UDG酶混合进行实时荧光定量PCR扩增反应，其中所述正向引物针对所述凸出片段设计，所述反向引物针对所述第一DNA片段的5’端设计，所述探针用于检测所述第一DNA片段；以及

获取所述实时荧光定量PCR扩增反应的CT值，将所述CT值带入由DNA聚合酶标准品建立的标准曲线中，得到所述待测DNA聚合酶的酶活性。

在一个实施方式中，所述由DNA聚合酶标准品建立的标准曲线通过如下操作得到：

将DNA聚合酶标准品进行梯度稀释，获得梯度酶活性的所述DNA聚合酶标准品；

在dNTP存在的条件下，分别将每一个酶活性的所述DNA聚合酶标准品与足量的所述待补平模板混合，得到多个补平模板，所述多个补平模板分别为每一个酶活性的所述DNA聚合酶标准品对应的补平模板；

分别将所述多个补平模板与正向引物、反向引物、探针、dNTP以及足量的UDG酶混合进行实时荧光定量PCR扩增反应；以及

获取每一个酶活性的所述DNA聚合酶标准品对应的实时荧光定量PCR扩增反应的CT值，根据所述CT值与酶活性的对应关系建立所述标准曲线。