[发明专利]检测DNA聚合酶活性的方法及检测试剂盒

权利要求书

1.一种检测DNA聚合酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供待补平模板，所述待补平模板包括第一模板链和第二模板链，所述第一模板链包括第一DNA片段，所述第二模板链包括第二DNA片段以及与所述第二DNA片段5’端相连接的凸出片段，所述第二DNA片段与所述第一DNA片段碱基互补，所述凸出片段中含有U碱基；

在dNTP存在的条件下，将待测DNA聚合酶与足量的所述待补平模板混合，使得所述第一DNA片段的3’端延伸形成补平片段，得到补平模板，所述补平片段与所述凸出片段碱基互补；

将所述补平模板与正向引物、反向引物、探针、dNTP以及足量的UDG酶混合进行实时荧光定量PCR扩增反应，其中所述正向引物针对所述凸出片段设计，所述反向引物针对所述第一DNA片段的5’端设计，所述探针用于检测所述第一DNA片段；以及

获取所述实时荧光定量PCR扩增反应的CT值，将所述CT值带入由DNA聚合酶标准品建立的标准曲线中，得到所述待测DNA聚合酶的酶活性。

2.根据权利要求1所述的检测DNA聚合酶活性的方法，其特征在于，所述由DNA聚合酶标准品建立的标准曲线通过如下操作得到：

将DNA聚合酶标准品进行梯度稀释，获得梯度酶活性的所述DNA聚合酶标准品；

在dNTP存在的条件下，分别将每一个酶活性的所述DNA聚合酶标准品与足量的所述待补平模板混合，得到多个补平模板，所述多个补平模板分别为每一个酶活性的所述DNA聚合酶标准品对应的补平模板；

分别将所述多个补平模板与正向引物、反向引物、探针、dNTP以及足量的UDG酶混合进行实时荧光定量PCR扩增反应；以及

获取每一个酶活性的所述DNA聚合酶标准品对应的实时荧光定量PCR扩增反应的CT值，根据所述CT值与酶活性的对应关系建立所述标准曲线。

3.根据权利要求1所述的检测DNA聚合酶活性的方法，其特征在于，所述第一模板链的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述第二模板链的碱基序列如SEQ ID No.2所示。

4.根据权利要求1所述的检测DNA聚合酶活性的方法，其特征在于，所述正向引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示，所述反向引物的碱基序列如SEQ ID No.4所示。

5.根据权利要求1所述的检测DNA聚合酶活性的方法，其特征在于，所述探针的碱基序列如SEQ ID No.5所示。

6.根据权利要求1所述的检测DNA聚合酶活性的方法，其特征在于，所述将待测DNA聚合酶与足量的所述待补平模板混合的操作中，混合的温度为25℃～40℃，混合的时间为0.5h～1.5h。

7.根据权利要求1所述的检测DNA聚合酶活性的方法，其特征在于，所述将所述补平模板、正向引物、反向引物、探针、dNTP以及足量的UDG酶混合进行实时荧光定量PCR扩增反应的操作中，所述荧光定量PCR扩增反应的热循环条件为：

45℃～55℃、20min～40min，1～3个循环；

93℃～97℃、5min～15min，1～3个循环；以及

90℃～100℃、15s～25s，50℃～60℃、15s～25s，70℃～75℃、25s～35s，35～45个循环。

8.根据权利要求1所述的检测DNA聚合酶活性的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶选自T4DNA聚合酶、Klenow酶和DNA聚合酶I中的至少一种。