[发明专利]一种可抑制NF‑κB蛋白活化的多肽及检测sORF表达的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更特别地，涉及一种可抑制NF-κB蛋白活化的多肽及其DNA编码片段，还涉及一种用于检测sORF的DNA构建体系统及检测方法。

背景技术

小开放性阅读框(sORFs)是一类广泛存在于各种生物细胞中具有编码潜能的核酸序列，且在多种生物组织中具有高度的保守性，因此推测该类序列编码产物具有重要的生物学功能。

随着高通量测序技术的广泛应用和蛋白质组学技术的进步，人们在不同生物组织中发现了越来越多的sORFs，并且部分sORFs编码产物的生物学功能也逐步被揭示。2003年，Guo团队在研究阿尔兹海默病时证实了一条由24个氨基酸组成的多肽(Humannin)具有神经保护性作用；2007年，Galindo团队在果蝇体内证实一段11个氨基酸的多肽能促进上皮细胞分化；2010年，Maki团队在大肠杆菌体内证实一段由sORF编码的43个氨基酸的短肽能影响葡萄糖转运。然而，由于这些短肽的分子量小，且易受到体内大分子蛋白的干扰，致使常规方法检测短肽表达困难，其生物学功能的研究进展缓慢。

近年来，有研究者对短肽检测及其生物学功能研究的方法进行探索。2016年，Shelley团队报道了一种T细胞翻译示踪方法，即运用免疫反应抗原呈递的方法间接证明sORF在体内可以编码产物。该方法利用已知的T细胞表面抗原肽活化T细胞，然后将该抗原肽的DNA序列与sORF的编码序列构建至载体，并将转染该表达载体的细胞与活化的T细胞共孵育，最终通过复杂的化学显色反应，证实sORF在体内能够表达。该方法虽具有一定的可行性，但是由于实验操作的复杂性及示踪肽设计的困难，限制了其广泛应用。

NF-κB是一种转录因子，NF-κB调控的荧光素酶表达载体是本领域常用的荧光素酶表达载体。2000年，Michael团队阐明NF-κB的活化需要IKKα/β与NEMO形成κB激酶复合体，并且证实了IKKα/β与NEMO相互结合的核心区域(NBD)，合成NBD多肽能抑制NF-κB活性。NF-κB作为生物体内重要的核转录因子，能够被多种炎症因子所活化，从而上调多种基因的表达。正常生理情况下，NF-κB在机体内始终保持一定活性和较高的丰度。

因此，为了促进生物体内活性小肽的研究，我们需要设计一种基于报告基因系统的方法，用来检测sORF编码多肽表达。

发明内容

发明人在研究过程中发现，NF-κB蛋白活化必须使IKKα/β与NEMO形成κB激酶复合体，并且其结合的核心氨基酸序列为TALDWSWLQTE(SEQ ID NO:1)，其对应的DNA序列为5’-ACGGCCCTAGACTGG AGCTGGTTACAGACGGAA-3’(SEQ ID NO:2)。

基于以上研究，本发明提供了一种可抑制NF-κB蛋白活化的多肽，其包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本发明还提供了上述可抑制NF-κB蛋白活化的多肽的DNA编码片段，其包含如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列或其同义突变体序列。

本发明还提供了一种用于检测sORF的DNA构建体系统，其包括NF-κB抑制多肽表达构建体和NF-κB调控的报告基因表达载体；

所述NF-κB抑制多肽表达构建体包含启动子和连接于所述启动子下游的上述DNA编码片段并且所述DNA编码片段的3’末端连接有终止密码子；

所述NF-κB调控的报告基因表达构建体包含NF-κB调控的报告基因表达框。

优选地，所述NF-κB调控的报告基因表达载体含有NF-κB调控的荧光素酶I表达框，并且DNA构建体系统还包括对照报告基因表达载体，所述对照报告基因表达载体包含不受NF-κB调控的荧光素酶II表达框，并且荧光素酶I和荧光酶II激发产生的荧光波长不同。

本发明还提供了一种用于检测序列中是否有sORF的方法，其包括以下步骤：

S1：将待检测序列插入权利要求3或4所述的DNA构建体系统中NF-κB抑制多肽表达构建体上，所述待检测序列连接于所述DNA编码片段的5’末端，并且保证从所述待检测序列的第一个ATG开始至所述DNA编码片段之间的核苷酸个数为3的倍数；

S2：将S1得到的含有所述待检测序列的NF-κB抑制多肽表达构建体和所述NF-κB调控的报告基因表达构建体导入于同一个表达宿主中；