[发明专利]一种乙型肝炎病毒基因组DNA的5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法

说明书

本发明公开了一种乙型肝炎病毒基因组DNA的5‑乙炔基‑2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法，具体的包括：(1)扩增NTCP基因，构建NTCP真核表达质粒pcDNA‑NTCP，将pcDNA‑NTCP转入Huh7肝癌细胞中构建NTCP稳定表达的Huh7‑NTCP细胞系；(2)使用EdU处理HepG2.2.15细胞，获取含EdU‑HBV的细胞上清，使用PEG8000处理，浓缩后进行HBV基因组拷贝数定量；(3)将HBV细胞传代培养至细胞汇合度为50‑80％时，使用EdU‑HBV感染Huh7‑NTCP细胞，然后进行EdU‑HBV荧光检测。本发明与现有技术相比，操作简单，图像结果无需进行后期处理，且各染色结果互不干扰。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种乙型肝炎病毒基因组DNA的5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法。

背景技术

乙型肝炎病毒简称乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)，是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)。HBV只对人和猩猩有易感性，其慢性感染与肝硬化及肝癌关系密切，是肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)最为重要的诱发因素。血清学证据证实全球人口中有30％曾感染过HBV，其中约2.5亿人是HBV慢性感染者，但迄今HBV致病机制仍未阐明。HBV具有严格的种属特异性，其自然宿主仅限于人和猩猩，且HBV病毒基因组虽仅包含3200bp，但结构有效，复制周期特殊，缺乏良好的动物模型和病毒标记技术严重限制了HBV相关机制研究。

HBV感染依赖于肝细胞表面特异性受体钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(sodiumtaurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)，决定了HBV感染的种属和组织特异性。HBV病毒结合受体NTCP入侵肝细胞后，病毒松散环状基因组DNA(RC-DNA)进入细胞核，经过修复形成共价闭合的环状DNA(cccDNA)，并结合宿主细胞组蛋白、病毒核心蛋白等以微小染色体形式存在。cccDNA转录形成pgRNA和亚基因组RNA，在Pol蛋白作用下，pgRNA在核衣壳内逆转录形成RC-DNA，包裹囊膜形成成熟病毒粒子，而RC-DNA还可转运胞核内再次形成cccDNA。cccDNA是HBV转录的唯一模板和体内病毒储存库，也是HBV持续存在的主要原因。

目前HBV感染及与细胞相互作用的分子机制等诸多方面仍不甚清楚，如HBV结合NTCP受体后，如何进一步侵染宿主细胞，cccDNA如何形成、维持及转录调控等，严重限制了HBV相关肝病的机制研究及针对HBV特异性治疗靶点的开发。建立HBV基因组DNA标记和检测方法，有助于HBV侵染和转录调控的分子机制研究，对探寻抑制和阻断HBV复制的潜在靶点具有重要的意义，然而迄今为止鲜有关于HBV基因组DNA标记和检测方法的报道。

发明内容

基于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种HBV基因组DNA的5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法，为HBV侵染过程和cccDNA维持及转录调控的分子机制等研究提供了重要的研究工具。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，公开了了5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷在对HBV基因组DNA进行标记和检测的应用；

本发明的第二方面，公开了一种HBV基因组DNA的5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法，所述方法包括如下步骤：

(1)扩增NTCP基因，构建NTCP真核表达质粒pcDNA-NTCP，将pcDNA-NTCP转入Huh7肝癌细胞中构建NTCP稳定表达的Huh7-NTCP细胞系；

(2)使用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)处理HepG2.2.15细胞，获取含EdU-HBV的细胞上清，使用PEG8000处理，离心，弃上清，对沉淀中进行HBV基因组拷贝数定量；