[发明专利]一种乙型肝炎病毒基因组DNA的5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法

权利要求书

1.一种用于非疾病诊断目的的HBV基因组DNA的5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)扩增NTCP基因，构建NTCP真核表达质粒pcDNA-NTCP，将pcDNA-NTCP转入Huh7肝癌细胞中构建NTCP稳定表达的Huh7-NTCP细胞系；

(2)使用EdU处理HepG2.2.15细胞，获取含EdU-HBV的细胞上清，使用PEG8000处理，离心，弃上清，对沉淀中进行HBV基因组拷贝数定量；

(3)将HBV细胞传代培养至细胞汇合度为50-80％时，使用EdU-HBV感染Huh7-NTCP细胞，然后进行EdU-HBV荧光检测。

2.如权利要求1所述的一种用于非疾病诊断目的的HBV基因组DNA的5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：

1)扩增NTCP基因，插入载体pcDNA3.0中，构建了NTCP真核表达质粒pcDNA-NTCP；

2)将pcDNA-NTCP转染Huh7细胞，使用遗传霉素G418进行筛选；

3)挑取遗传霉素G418抗性阳性克隆，使用间接免疫荧光试验和qRT-PCR检测NTCP表达；

4)选择NTCP高表达克隆，扩大培养；

5)感染HBV，用ELISA检测HBsAg，确定Huh7-NTCP细胞系支持HBV感染性。

3.如权利要求2所述的一种用于非疾病诊断目的的HBV基因组DNA的5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法，其特征在于，对构建的pcDNA-NTCP质粒进行线性化。

4.如权利要求3所述的一种用于非疾病诊断目的的HBV基因组DNA的5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法，其特征在于，对pcDNA-NTCP质粒进行线性化的所用的线性化酶为PvuI内切酶。

5.如权利要求2所述的一种用于非疾病诊断目的的HBV基因组DNA的5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法，其特征在于，对NTCP基因进行扩增时的选用的扩增引物为：

pC3NTCP-F:CCCAAGCTTGCCACCATGGAGGCCCACAACGCGTCTG；

pC3NTCP-R:CCGCTCGAGCTAGGCTGTGCAAGGGGAGCAG。

6.如权利要求2所述的一种用于非疾病诊断目的的HBV基因组DNA的5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法，其特征在于，对NTCP扩增基因和pcDNA3.0进行酶切选用的限制性内切酶为HindIII和XhoI；

遗传霉素G418的使用浓度为700ug/ml，使用遗传霉素G418进行筛选的时间为4-6周；

进行qRT-PCR时，选用GAPDH为内参，各引物序列分别为：

hNTCP-qF:GGGACATGAACCTCAGCATT；

hNTCP-qR:CGTTTGGATTTGAGGACGAT；

hGAPDH-qF:GGAGTCCACTGGCGTCTTCAC；

hGAPDH-qR:GAGGCATTGCTGATGATCTTGAGG。

7.如权利要求1所述的一种用于非疾病诊断目的的HBV基因组DNA的5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法，其特征在于，所述步骤(2)包括：

1)将HepG2.2.15肝癌细胞使用MEM培养基进行传代培养，更换含10μM EdU和2％胎牛血清FBS的MEM培养基再进行传代培养，收集细胞上清；然后再补加含10μM EdU和2％FBS的MEM培养基进行传代培养并收集细胞上清一次；

2)对收集的细胞上清进行病毒纯化，去除细胞碎片及杂质，然后向细胞上清中加入PEG8000，冰上缓慢混匀4-6h；离心，弃上清，对沉淀中进行HBV基因组拷贝数定量。