[发明专利]一种微囊藻毒素降解菌的快速高效筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于微囊藻毒素微生物处理技术领域，具体涉及一种微囊藻毒素降解菌的快速高效筛选方法。

背景技术

随着现代社会的飞速发展，大量含氮磷的有机物以及工农业废水排入自然水体中，使得水体发生富营养化，导致藻类快速繁殖形成“水华”，蓝藻细胞破裂后向水体中释放出多种毒素。其中微囊藻毒素 (Microcystin, MC) 是一类出现频率最高、造成危害最严重的藻毒素，它不仅会对动植物造成损伤，甚至引发人类肝损伤和肝癌，严重威胁人类的健康。微囊藻毒素的化学性质因其独特的环状结构显得非常稳定，一般的水处理工艺达不到较好的去除效果，一般的多肽酶也不能将其分解。目前，利用微生物降解来去除MCs是相对最有效、安全的方法，微生物降解已成为环境中MCs自然归趋的主要途径之一。

目前已经被证明有降解MCs作用的菌株大部分集中在α-变形菌纲中的Sphingomonas和Sphingopyxiz这两个属，此外如青枯菌(Ralstonia solanacearum)、食酸戴尔福特菌、伯克霍尔德氏菌，吉氏库特菌，荧光假单胞菌等也被证明有降解作用。目前，MCs降解菌的筛选鉴定方法比较复杂，检测分离纯化的菌株能否降解MCs时需要用到大量的MCs作为材料，实验室自行纯化MCs工作量大、产量低，而MCs纯品价格昂贵。后期对MCs的浓度测定时无论是用HPLC还是ELISA，成本均较大。一般从腐烂藻体水中分离出的细菌数量较多，对其一一进行MCs降解实验不仅工作量大而且会消耗大量的实验资金。

发明内容

本发明公开了一种微囊藻毒素降解菌的快速高效筛选方法，通过设计引物对，根据检测结果来确定其能否降解MCs，从而公开了一种新型的、快速筛选MCs降解菌的方法，进而得到可有效降解微囊藻毒素的降解菌。

本发明采用如下技术方案，一种微囊藻毒素降解菌的快速高效筛选方法，包括以下步骤，

（1）设计如SEQ ID NO：1以及SEQ ID NO：2所述的引物对；

SEQ ID NO：1 : 5'-TGCGCTATGGGKCAGATCC-3'

SEQ ID NO：2:5'-GGTCAAACTTCTTGAGSAGCTG-3'

（2）以待筛选微囊藻毒素降解菌的DNA为模板，利用步骤（1）的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；

（3）检测步骤（2）的扩增产物，根据检测结果完成微囊藻毒素降解菌的筛选。

上述技术方案中，所述PCR扩增采用25µL反应体系，其中ddH₂O 17.2 µL，10×PCR缓冲液(Mg²⁺ plus) 2.5 µL，dNTPs（2.5 mM）2 µL，引物(10 µM) 各1 µL，rTaq DNA聚合酶（5 U/µL）0.3 µL，模板1 µL。

上述技术方案中，所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性10 min，94℃ 变性30 s，55℃ 退火30 s，72℃ 延伸30 s，共40个循环，最后72℃ 延伸5 min后，4℃ 保存。

上述技术方案中，检测步骤（2）的扩增产物具体为步骤（2）的扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离、EB 染色、紫外检测。

本发明还公开了一对特异性的引物：

SEQ ID NO：1 : 5'-TGCGCTATGGGKCAGATCC-3'

SEQ ID NO：2:5'-GGTCAAACTTCTTGAGSAGCTG-3'

使用该对引物扩增可以快速筛选出能够降解MCs的菌株中mlrA基因的保守区，长132bp，具STS序列特点。本发明对菌株进行PCR扩增，检测获得阳性结果的可认为是藻毒素降解菌；因此本发明还公开了上述引物对在微囊藻毒素降解菌筛选中的应用。

本发明还公开了一种微囊藻毒素降解的方法，包括以下步骤，

（1）设计如SEQ ID NO：1以及SEQ ID NO：2所述的引物对；

SEQ ID NO：1 : 5'-TGCGCTATGGGKCAGATCC-3'

SEQ ID NO：2:5'-GGTCAAACTTCTTGAGSAGCTG-3'

（2）以待筛选微囊藻毒素降解菌的DNA为模板，利用步骤（1）的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；

（3）检测步骤（2）的扩增产物，根据检测结果选择微囊藻毒素降解菌；