[发明专利]检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒及反应体系

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测基因突变的试剂盒、反应体系及方法，特别涉及一种检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒、反应体系及方法。

背景技术

一直以来肺癌都位居全球癌症相关死亡的首位。世界卫生组织国际癌症研究署发布的癌症报告显示：全球肺癌新发病例预测约161万例，死亡约138万例，分别占恶性肿瘤新发病例及死亡病例的13％及18％，居恶性肿瘤第一位，其中非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)占肺癌的80％以上。尽管肺癌的诊断方法和治疗手段不断提高，肺癌的死亡率仍未得到有效控制，患者的预后较差，5年生存率仍<20％。

人类表皮生长因子受体家族(epidermal growth factor receptor family,EGFR家族)属于酪氨酸激酶受体家族，是一种多功能糖蛋白，其广泛分布于人体各组织细胞膜上，是原癌基因的表达产物，其基因位于第七号染色体短臂上(7p12)，由188.307K个碱基组成，共有28个外显子，EGFR具有酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)区，其是传递胞外信号到胞内的重要途经蛋白，并由外显子18.24编码。EGFR家族成员的结构相似，都包括胞外段、跨膜区和胞内段三部分。胞外段为受体与配体结合部，跨膜段为疏水部，将受体固定于细胞膜上，胞内区有典型的ATP结合位点和酪氨酸激酶区，其酪氨酸激酶活性在调节细胞增殖及分化中起着至关重要的作用。当配体与受体结合后，引起受体的二聚化作用，形成同型或异型二聚体，二聚化的受体发生交联磷酸化，即一个受体和另外一个受体上特定的酪氨酸残基磷酸化，激活胞内区的TK亚区，从而激发下一级信号传导。非小细胞肺癌EGFR突变85％以上发生在外显子19的缺失突变及外显子21的L858R点突变。

近年来，表皮细胞生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制物(TKIs)吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼等被证明对具有EGFR激活突变的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者具有显著疗效，EGFR-TKI成为非小细胞肺癌治疗的里程碑。但同时，几乎所有初始时对EGFR-TKI反应良好的患者会在6-12个月内出现耐药、疾病进展，称为“获得性耐药”。

许多研究已证实EGFR的突变状态决定了肿瘤对EGFR-TKI的反应，研究表明EGFR-TKI药物对于EGFR L858R和EGFR外显子19缺失突变的患者作用显著，尤其是EGFR基因外显子19发生缺失突变的非小细胞肺癌患者对该类药物敏感，即受体酪氨酸激酶抑制剂药物对这些患者有疗效。因此EGFR外显子exon19缺失突变准确的检测，可以为筛选靶向治疗患者提供参考；同时可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测。但外显子19缺失突变主要是发生9、12、15、18、24个核苷酸的框内缺失突变，其缺失形式较多，为检测其缺失情况带来一定困难。

目前检测EGFR基因突变最常用的样本来源是肿瘤的病理组织或细胞学标本，但是组织取材均为有创操作，有时难以实施，且这些操作受肿瘤大小、部位、患者一般情况等影响，有时不能取得满意的组织或组织量太少不能进行基因突变检测。并且随着疾病的进展和EGFR-TKIs耐药性的出现，常常需要再次进行分子生物学检测，而组织取材为有创操作，不能便捷、反复进行。近些年血浆游离DNA(ctDNA)被认为是一种可能代替肿瘤组织用来检测肿瘤特异性改变的样本。肿瘤组织、肿瘤细胞坏死及脱落的肿瘤细胞进入血液后凋亡释放游离DNA进入外周血。ctDNA用于肿瘤突变检测优势在于：操作无创；在疾病的任一进程中都可获取；可以作为一种肿瘤标记物，实现实时检测和动态监测；克服肿瘤组织的异质性。因此，使用外周血游离DNA监测患者EGFR基因突变状态，探索患者EGFR-TKI耐药机制及预测预后成为一条可行的途径。然而，目前使用ctDNA检测EGFR基因突变仍有一些技术上的挑战。1)ctDNA含量因人而异，并且大多数人含量较低；2)ctDNA片段相对小，约为180bp：3)ctDNA中肿瘤相关的DNA所占比例不同人差别较大，并且常因比例小而难以测出；4)以前的研究显示，与肿瘤组织相比，ctDNA检测EGFR突变灵敏度仅为43-66％。因此，高灵敏度的ctDNA EGFR基因突变检测技术的发展十分重要。

综上所述，本领域迫切需要一种能够基于非肿瘤组织，高灵敏度、高准确性和高可靠性地检测患者中EGFR外显子19缺失突变的方法。