[发明专利]一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物、检测盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及细菌检测技术领域，具体涉及一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物、检测盒及其应用。

背景技术

牛多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）为巴氏杆菌科巴氏杆菌属成员，革兰氏阴性菌，显微镜下观察为短小的杆状或者球状，两端钝圆、没有鞭毛、不形成芽孢。生化特性为需氧或兼性厌氧、对营养的要求较高；可分解甘露糖、葡萄糖、蔗糖和果糖、产酸不产气。有荚膜的菌株抗性较强，多见于临床病料新分离菌株。该菌易感染月龄较小的犊牛，引起地方性的新生犊牛肺炎、运输热或者断奶牛肺炎；实际生产中这些疾病的产生通常伴随着各种应激因素，如不利的气候影响、不良的营养状况、长途运输等。尤其是该菌在呈急性感染时会表现为出血性败血症，导致病畜迅速死亡。目前根据细菌的荚膜血清反应将该菌可以分为A、B、D、E和F5种荚膜血清型，其中临床上对牛有致病性的为A、B和E型。至2006年报道分离A型菌株以来，我国其它地区如天津、宁夏、内蒙古、新疆、湖北、吉林和山东等地也相继报道分离了A型菌株，表明我国从北部到中部都存在该病的流行。由于该病对养牛业的危害极大，因此对该病的诊断就显得尤为重要。

传统的牛多杀性巴氏杆菌检测方法主要是通过实验室手段进行细菌的分离和相关的生化鉴定、血清学鉴定；近些年也出现了常规PCR鉴定、套式PCR鉴定和荧光定量PCR鉴定。这些方法往往存在需要精密仪器和特殊实验条件的限制，制约了现地应用。因此，建立一种实际应用性强的检测技术在基层推广应用，具有很强的临床意义。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种新颖的恒温核酸扩增方法，它是一种灵敏的链置换技术，可以在恒温条件下和短时间内将目标DNA从几个拷贝扩增到10⁹~10¹⁰拷贝。LAMP技术的基本原理是针对靶序列的6个区域，设计4条特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶-Bst DNA polymerase 在等温条件下进行反应。同一链上的一组引物顺序地退火到靶序列，在链置换DNA聚合酶的作用下，后阶段退火的引物置换前面引物所形成的链。置换发生在两条链上，对引物设计的要求是能形成环状结构。反应在恒温条件下进行，链的变性是由链置换产生的。LAMP反应形成一系列不同长度茎环结构的DNA再通过特定的方法判断扩增与否。该方法具有方便快速、操作简单、敏感性高、适用性强、结果准确等特点，而且对实验所用的仪器要求非常低，一台普通的水浴锅就可以完成全部实验反应。

为了实现牛多杀性巴氏杆菌的快捷、准确和简易检测诊断，很有必要提供一种利用LAMP技术检测牛多杀性巴氏杆菌的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测方法，使其能够快速、准确地对疑似样品进行检测，以克服现有方法在临床实用性上的不足。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物，由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3组成，其中，各引物的序列分别为：

FIP：GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG，

BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC，

F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC，

B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。

本发明提供了上述牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物在检测牛多杀性巴氏杆菌中的应用。

一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒，包含检测溶液，每24μL检测溶液中包括：

10×Thermo Pol反应缓冲液 2.5μL

正向内引物FIP1.0μmol/L

反向内引物BIP1.0μmol/L

正向外引物F3 0.4μmol/L

反向外引物B3 0.4μmol/L

MgSO₄1.0mmol/L

dNTP 1.6nmol/L

Bst DNA聚合酶320000U/L

显色试剂 3mmol/L

DEPC水 补足至24μL，

其中，各引物的序列分别为：