[发明专利]一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物、检测盒及其应用

权利要求书

1.一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物，其特征在于：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3组成，其中，各引物的序列分别为：

FIP：GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG，

BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC，

F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC，

B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。

2.如权利要求1所述的牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物在检测牛多杀性巴氏杆菌中的应用。

3.一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：包含检测溶液，每24μL检测溶液中包括：

10×Thermo Pol反应缓冲液 2.5μL

正向内引物FIP1.0μmol/L

反向内引物BIP1.0μmol/L

正向外引物F3 0.4μmol/L

反向外引物B3 0.4μmol/L

MgSO₄1.0mmol/L

dNTP 1.6nmol/L

Bst DNA聚合酶320000U/L

显色试剂 3mmol/L

DEPC水 补足至24μL，

其中，各引物的序列分别为：

FIP：GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG，

BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC，

F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC，

B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。

4.如权利要求3所述的牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述显色试剂为羟基萘酚蓝，在恒温扩增反应前加入。

5.如权利要求3或4所述的牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒在检测牛多杀性巴氏杆菌中的应用。

6.利用如权利要求3或4所述的牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒检测牛多杀性巴氏杆菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤S1：当原始病料样品为液体样本时，取所述液体样本1mL在12000rpm/min条件下离心2min后起弃掉上清，再用PBS缓冲液1 mL重悬沉淀，12000rpm/min条件下离心2min后再次弃掉上清；然后利用100μL PBS缓冲液将沉淀吹悬后，取1μL作为样品模板DNA；当原始病料样品为固体样本时，取所述固体样品的病变与正常交界处的组织0.5g，加入10倍的PBS缓冲液无菌研磨，冻融2次后无菌纱布过滤，然后将获得的滤液采用前述液体样本的方法进行处理，得到样品模板DNA；

步骤S2：取1μL的样品模板DNA加入24μL所述环介导等温扩增检测试剂盒中的检测溶液，62℃恒温反应1小时；

步骤S3：观察反应结束后溶液的颜色变化，阳性结果显示为天蓝色，阴性结果显示为紫色。

7.如权利要求6所述的利用牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒检测牛多杀性巴氏杆菌的方法，其特征在于：所述样品模板DNA，是疑似感染牛多杀性巴氏杆菌的患病动物组织样品的基因组。