[发明专利]改进的短同聚重复的检测

说明书

本申请涉及检测短同聚核酸重复、特别是短同聚微卫星中的核苷酸数量的变化，例如用于诊断肿瘤中的微卫星不稳定性(MSI)和/或错配修复缺陷(MMR‑)的目的。因此，提供了用于检测段同聚核苷酸重复序列中存在的核苷酸数量的变化的方法以及用于自动化检测所述变化的试剂盒(kit)和筒(cartridge)。

技术领域

本申请涉及检测短同聚核酸重复、特别是短同聚微卫星中的核苷酸数量的变化，例如用于诊断肿瘤中的微卫星不稳定性(MSI)和/或错配修复缺陷(MMR-)的目的。因此，提供了用于检测段同聚核苷酸重复序列中存在的核苷酸数量的变化的方法以及用于自动化检测所述变化的试剂盒(kit)和筒(cartridge)。

发明背景

DNA错配修复(MMR)是一种进化保守的多因子系统，用于识别和修复进入基因组中碱基的错误插入或缺失(“插入缺失(indel)”)，其可能在复制或重组过程中或修复某些形式的DNA损伤过程中发生。与上述一致，有证据表明MMR受损与基因组不稳定性相关，因此也与癌症进展有关。

事实上，在包括白血病、卵巢癌、胰腺癌或胃癌的几种癌症类型中已经描述了MMR缺陷，并且MMR缺陷是造成Lynch癌症易感综合征的确定原因，该综合征占所有子宫内膜(EM)或结直肠(CRC)肿瘤的2-5％(Jiricny,2006)。重要的是，MMR缺陷肿瘤在标准癌症治疗后显示不同的预后和治疗结果(Ng and Schrag,2010)。例如，来自CRC患者的MMR缺陷型肿瘤似乎对基于5-氟尿嘧啶的化疗没有反应(Fischer et al.,2007)，所述化疗是CRC的首选化疗。此外，MMR缺陷型肿瘤还倾向于对经常用于EM癌症治疗的顺铂和卡铂的抗性(Hewishet al.,2010)。最后，还观察到这些肿瘤相对较快地产生对靶向治疗的抗性，这可能是由于它们的可突变性增加，并且因此也更容易获得能够潜在影响其他抗癌防御的二次突变。

由于事实上MMR缺陷被证实会影响患者对癌症治疗的反应，因此MMR缺陷的有效检测可能会对患者的有效管理并对患者的生存产生深远的影响。由于影响MMR通路的突变的复杂性，在临床实践中，通过筛选MMR缺陷的直接后果是DNA复制错误而不是对MMR基因例如MLH1、MSH2、MSH6或PMS2中选择的突变进行详细筛选从而测试MMR缺陷更为常见(Peltomaki,1997)。被称为微卫星的短串联重复序列长度变异的变化(一种被称为微卫星不稳定性或MSI的现象)最好地表现了这些DNA复制错误。

微卫星通常是大片的一至五个核苷酸的DNA基序相邻重复5至50次(即，串联重复)。它们广泛分布于整个完整的哺乳动物基因组中，并且最常位于基因组的非编码部分。由于这个原因，许多微卫星都是生物沉默的，这使得它们能够在世代中累积无害的突变，这能够用于DNA指纹分析或其他鉴定目的。然而，在单个个体组织中但不在周围组织中的多个微卫星中的一个或多个微卫星重复单元的克隆丢失(缺失)或获得(插入)是缺陷复制的标志并强烈表明受损的MMR和发展癌症的倾向(Pinol et al.,2005)。

目前，MSI分析的金标准包括在癌症患者DNA中对至少5种微卫星标志物的长度进行基于PCR的测试，所述微卫星标志物包括长度为25和26个核苷酸的2个单或同聚物(BAT25、BAT26)和3个二核苷酸重复序列的2个单或同聚物(D2S123、D5S346、D17S250)(Boland et al,1998)。这5种MSI标志物的组由美国马里兰州贝塞斯达的国家癌症研究所研究会首次提出，因此现在被广泛称为贝塞斯达组。如果标志物中30％或更多的标志物(5种标志物的组中的至少2种)被测试为不稳定的，则用贝塞斯达组测试的样品被指定为具有高频率的MSI或“MSI-H”表型。如果五种标志物中的一种标志物(或肿瘤标志物中<30％的标志物)被评分为MSI阳性，则该样品被指定为MSI-低或“MSI-L”。最后，如果没有发现标志物发生改变，则样品被认为是MSI-稳定或“MSS”(Boland et al,1998)。