[发明专利]一种以邻苯二酚为底物高效合成咖啡酸的方法

说明书

本发明公开了一种以邻苯二酚为底物高效合成咖啡酸的方法，属于生物化工领域。本发明构建的重组菌以邻苯二酚、丙酮酸钠和氯化铵合成咖啡酸时，咖啡酸的产量可达到1.51g/L，由于邻苯二酚、丙酮酸钠和氯化铵均为相对廉价的化合物，因此本发明方法是一种具有较大潜力的咖啡酸生物合成方法。与以往的以L‑酪氨酸为底物的生物转化方法相比，本发明方法在咖啡酸产量方面有了明显的提高。与化学合成方法相比，该方法的产物为单一的反‑咖啡酸，不需要对同分异构体进行进一步的分离。

技术领域

本发明涉及一种以邻苯二酚为底物高效合成咖啡酸的方法，属于生物化工领域。

背景技术

咖啡酸是一种高价值的芳香类化合物，结构上可划分为羟基肉桂酸，其同时具有酚羟基和丙烯酸2个官能团。体内和体外研究表明，咖啡酸具有一系列生理功能。例如，通过氧化机制，咖啡酸可以抑制癌细胞增殖；咖啡酸具有免疫调节和抗炎活性；咖啡酸亦可作为抗氧化剂，且优于其他天然化合物；另外，咖啡酸还具有抗病毒、抗抑郁、治疗糖尿病等活性。

作为木质素合成的关键中间代谢产物，咖啡酸存在于几乎所有植物中。该途径以L-酪氨酸或L-苯丙氨酸为前体，涉及到反-肉桂酸4-单加氧酶(CYP73A)、苯丙氨酸/酪氨酸氨基裂合酶、对香豆酸3-羟化酶等。然而，咖啡酸在植物中的含量普遍很低，因此提取困难。另一方面，化学方法合成的咖啡酸为顺势咖啡酸和反式咖啡酸的混合物；且由于结构的相似性，完全分离纯化出单一的任一化合物都较为困难。

通过合成生物学途径策略，将咖啡酸在植物中的合成途径平移至微生物底盘中，构建具有咖啡酸合成能力的工程菌是目前主要的研究思路。然而，由于酪氨酸等底物的溶解性较差，该类工程菌的咖啡酸产量和对底物的转化率均较低。通过以L-酪氨酸高产菌株作为咖啡酸异源合成途径的底盘，有助于解决该问题，然而效果并不理想，其表现为生产周期较长，且产量并未显著提高。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种咖啡酸的生物合成方法，为此，本发明首先提供了一种共表达酪氨酸苯裂合酶EhTPL和酪氨酸氨基裂合酶RgTAL的重组大肠杆菌，在较宽的底物浓度范围及反应条件下，均能有效合成咖啡酸。

所述的酪氨酸苯裂合酶EhTPL来源于草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码酪氨酸苯裂合酶的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的酪氨酸氨基裂合酶RgTAL来源于粘红酵母(Rhodotorula glutinis)，其氨基酸序列如 SEQ ID NO.2所示，编码酪氨酸氨基裂合酶的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所用的表达载体为pET28a(PB)，该载体用于单独表达EhTPL 或RgTAL，或通过ePathBrick构建EhTPL和TcXAL的共表达结构。其DNA序列为SEQID NO.5。

在本发明的一种实施方式中，基因EhTPL和RgTAL通过ePathBrick策略构建不同的共表达结构。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌含有通过pET28a(PB)以假操纵子的结构顺序表达EhTPL和RgTAL基因的重组质粒pPsdOpr2。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌含有通过pET28a(PB)以单顺反子的结构顺序表达EhTPL和RgTAL基因的重组质粒pMnCisTr2。

本发明还提供应用所述重组大肠杆菌以邻苯二酚、丙酮酸钠和氯化铵等低值化合物作为底物，通过全细胞转化合成咖啡酸的方法。

在本发明的一种实施方式中，重组大肠杆菌的培养使用TB培养基。