[发明专利]一种苹果酵素及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种苹果酵素的制备方法，其特征在于所述的制备方法即以新鲜成熟度好的苹果为主材料，以毕赤酵母菌Pichia kudriavzevi PKD 3001和植物乳杆菌Lactobacilusplantarum C2001为第一次发酵菌株、沪酿1.01醋酸菌为第二次发酵菌株通过两次发酵制备而成，该制备方法具体包括以下步骤：

(1)、菌种的选取

所用的植物乳杆菌Lactobacilus plantarum C2001，是2016年1月18日于中国典型培养物保藏中心保藏的，其保藏编号为CCTCC NO:M 2016045的植物乳杆菌Lactobacilusplantarum C2001冷冻干燥管；

所用的毕赤酵母菌Pichia kudriavzevi PKD 3001，是2016年9月29日于中国典型培养物保藏中心保藏的，其保藏编号为CCTCC NO:M 2016537的毕赤酵母亚种Pichiakudriavzevi PKD 3001冷冻干燥管；

所用的沪酿1.01醋酸菌为巴氏醋酸杆菌巴氏亚种Acetobacter pasteurianussubsp.Pasteurianus De Ley et Frateur，购买自上海市酿造科学研究所；

(2)、发酵原料液的制备；

将新鲜、成熟度好的苹果用自来水清洗干净后经吹干、去核、用榨汁机进行榨汁、用100目纱布过滤得到苹果汁，然后与纯净水混合，得到原料混合物，其中苹果汁与纯净水的比例，按体积百分比计算，苹果汁：纯净水5-20％：80-95％；

在上述所得的原料混合物中再加入为原料混合物总重量1-5％的葡萄糖，经1mol/L食用碳酸钠水溶液调pH值为5.0-7.0，然后于105℃灭菌10min得到发酵原料液；

(3)、菌种活化

用接种环取无菌水溶解的冷冻干燥管保存的毕赤酵母亚种Pichia kudriavzevi PKD3001菌种一环在马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养皿上划线，在30℃培养箱中培养24h，得到平板活化毕赤酵母菌菌种；

用接种环取无菌水溶解的冷冻干燥管保存的植物乳杆菌Lactobacilus plantarumC2001菌种一环在乳酸菌琼脂培养基培养皿上划线，在37℃培养箱中培养24h，得到平板活化植物乳杆菌菌种；

用接种环取无菌水溶解的沪酿1.01醋酸菌菌种一环在醋酸菌琼脂培养基培养皿上划线，在30℃培养箱中培养24h，得到平板活化醋酸菌菌种；

(4)、种子培养

用接种环取步骤(3)所得的平板活化毕赤酵母菌菌种一环接入装有50ml麦芽浸粉肉汤液体培养基的250ml规格的三角瓶中，置于温度30℃的培养箱中，然后控制转速为120rpm，恒温培养36h，离心所得的沉淀用0.01mol/L无菌磷酸缓冲盐溶液清洗后，加入50mL0.01mol/L无菌磷酸缓冲盐溶液经500rpm下漩涡震荡重悬菌体，得到毕赤酵母菌种子液，每毫升毕赤酵母菌种子液中含毕赤酵母菌种1×10⁶-1×10⁹cfu；

用接种环取步骤(3)所得的平板活化植物乳杆菌菌种一环接入装有50ml乳酸菌肉汤培养基的250ml规格的三角瓶中，置于温度37℃的培养箱中，恒温培养36h，离心所得的沉淀用0.01mol/L无菌磷酸缓冲盐溶液清洗后，加入50mL 0.01mol/L无菌磷酸缓冲盐溶液经500rpm下漩涡震荡重悬菌体，得到植物乳杆菌种子液，每毫升植物乳杆菌种子液中含植物乳杆菌种1×10⁷-1×10¹⁰cfu；

用接种环取步骤(3)所得的平板活化醋酸菌菌种一环接入装有50ml醋酸菌液体培养基的250ml规格的三角瓶中，置于温度30℃的培养箱中，然后控制转速为120rpm，恒温培养36h，离心所得的沉淀用0.01mol/L无菌磷酸缓冲盐溶液清洗后，加入50mL 0.01mol/L无菌磷酸缓冲盐溶液经500rpm下漩涡震荡重悬菌体，得到醋酸菌种子液，每毫升醋酸菌种子液中含醋酸菌种1×10⁶-1×10⁸cfu；

(5)、发酵培养

首先，将毕赤酵母菌种子液和植物乳杆菌种子液按体积比，即毕赤酵母菌种子液：植物乳杆菌种子液1：1-5的比例进行混合，得到毕赤酵母菌和植物乳杆菌混合种子液；

然后，按步骤(2)所得的发酵原料液体积的1-5％的比例，在步骤(2)所得的发酵原料液中加入上述所得的毕赤酵母菌和植物乳杆菌混合种子液，控制温度为25-35℃、转速100-200rpm进行恒温发酵12-48h，得到第一次发酵液；

然后，按第一次发酵液体积的1-10％的比例，在第一次发酵液中加入醋酸菌种子液，控制温度25-35℃、转速100-200rpm进行第二次发酵12-36h，得到第二次发酵液；

(6)、灭菌

将步骤(5)所得的第二次发酵液于121℃下杀菌20min，然后灌装，即得到苹果酵素。