[发明专利]一种高特异性的碱基突变多重PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，包括：在无3’‑5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶的作用下，在焦磷酸盐存在的环境下，使用多对修饰引物进行PCR扩增，修饰引物的上下游引物的3’末端均是双脱氧核苷酸，该3’末端与待检测突变型模板上下游序列互补，DNA聚合酶依赖模板而焦磷酸解所述修饰引物的3’末端与模板互补的双脱氧核苷酸，多对引物特异性结合模板并正常延伸，实现多重PCR扩增。本发明解决了多重PCR非特异性条带干扰和引物二聚体的问题，提高检测特异性和灵敏度，增加体系对引物的容量；可针对肿瘤患者或健康人采集的体液DNA进行检测。

技术领域

本发明涉及基因突变检测技术领域，尤其涉及一种高特异性的碱基突变多重PCR检测方法。

背景技术

在等位基因特异性PCR(allele specific PCR,AS-PCR)技术出现之前，常用检测基因突变的方法是PCR富集突变点序列进行Sanger测序检测多种突变，Sanger测序的质量对片段长度有要求，大于100bp且突变位点在序列中部，检测结果较为准确，对于100bp以下的小片段常常出现测序质量低的问题；另外Sanger测序的灵敏度能检测≥5％的基因突变，显然不能满足游离DNA短片段低频突变的检测要求。

AS-PCR利用碱基错配阻滞扩增的原理，设计特异的正向引物和远端反向引物，引物3’端与SNP的突变型基因型相同，只有突变型模板能被扩增，野生型模板无法扩增。增加了扩增反应的特异性，突变型模板信号被放大，灵敏度达到1％。这种方法可以用来检测基因频率≤10％的突变，特异性低于2.5％。

2000年，Liu和Sommer在AS-PCR基础上进行改进，将引物3’端脱氧核苷酸dNMP更换为双脱氧核苷酸ddNMP，使用无3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶，只有3’末端与模板互补的引物发生焦磷酸解才能进行扩增，不互补的引物则无法扩增。这种扩增依赖焦磷酸解反应的激活，称为焦磷酸解激活聚合反应(Pyrophosphorolysis-activated polymerization，简称PAP)。与传统的AS-PCR相比，这一改进显著增加了扩增的选择性和特异性。

2006年，Liu和Sommer使用的聚合酶是在F667Y突变和N端删除的Taq DNA聚合酶，该酶切除了5’-3’核酸外切酶结构，扩增产物突变错配率是Taq DNA聚合酶的1/2，能够准确地对引物3’端进行焦磷酸解反应。Liu和Sommer针对8个杂合缺失位点设计了8对引物，正反向引物3’端均添加双脱氧核苷酸ddNMP进行多重PCR，有效提高反应特异性，同时避免引物二级结构的发生。

现有技术存在以下缺点：(1)非特异性，多重PCR由于引物之间Tm值差异，退火温度较低时，Tm值较高的引物对易出现非特异性扩增，或者引物与模板的错配都有可能产生非特异性扩增产物；(2)二级结构，多对引物存在同一反应体系中易形成二级结构，尤其是引物3’端连续4bp有反向互补序列容易形成引物二聚体；(3)由于存在以上两个问题，单一多重PCR体系包含的扩增目的条带种类十分有限。

发明内容

本发明旨在解决多重PCR非特异性条带干扰和引物二聚体的问题，提高检测特异性和灵敏度，增加体系对引物的容量；可针对肿瘤患者或健康人采集的体液DNA进行检测。

因此，本发明提供一种高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，包括：在无3’-5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶的作用下，在焦磷酸盐存在的环境下，使用多对修饰引物进行PCR扩增，上述修饰引物的上下游引物的3’末端均是双脱氧核苷酸，该3’末端与突变位点上下游的野生型序列互补，上述DNA聚合酶依赖模板而焦磷酸解上述修饰引物的3’末端与模板互补的双脱氧核苷酸，引物正常延伸，实现多重PCR扩增，产物包含野生型与突变型DNA片段。

进一步地，上述修饰引物是预先合成的3’末端缺少上述双脱氧核苷酸的寡核苷酸，在末端脱氧核苷酸转移酶和ddNTP的存在下，将双脱氧核苷酸加到上述寡核苷酸的3’末端而得到的引物。