[发明专利]马铃薯微卫星标记位点开发方法与微卫星标记位点内的微卫星标记的长度检测方法

权利要求书

1.一种马铃薯微卫星标记位点开发方法，其特征在于，所述开发方法包括：

将n个具有多态性的马铃薯样本等质量混合，获得混合样本，其中n＞1，选择所述n个具有多态性的马铃薯样本的方法包括：选择外部形态不同的马铃薯样本、生物分类不同的马铃薯样本、标记互不相同的马铃薯样本或不同生态区域的野生资源的马铃薯样本；

提取所述混合样本的基因组；

将所述混合样本的基因组片段化，获得基因组片段；

将多个具有简单重复序列的探针作为探针组，利用所述探针组中的每个探针分别与所述基因组片段进行杂交，获得多个杂交溶液，所述探针的数量为12个，每个所述探针的简单重复序列中的重复单元为CT、GA、TG、AC、TA、TGT、CCA、ATC、CCT、AGA、ATG或CAA，每个所述探针的简单重复序列的重复次数为6～20，对多个所述杂交溶液中成功杂交的基因组片段分别进行纯化，得到多个纯化的杂交基因组片段；

将多个所述纯化的杂交基因组片段等质量混合后，利用高通量测序检测混合后的所述纯化的杂交基因组片段，获得第一高通量测序片段；

从所述第一高通量测序片段中，筛选有效的所述高通量测序片段，所述有效的高通量测序片段包括微卫星标记位点内的微卫星标记，所述有效的高通量测序片段中的所述微卫星标记的两侧序列的碱基数均≥1个，且所述有效的高通量测序片段中的所述微卫星标记中至少有一侧的序列的碱基数≥10个；

根据所述有效的高通量测序片段中的微卫星标记的两侧序列的同源性对所述有效的高通量测序片段进行分类，同一类的所述有效的高通量测序片段为同一个微卫星标记位点的所述有效的高通量测序片段，若同一个所述微卫星标记位点的所述有效的高通量测序片段的条数≥α1，则成功开发一个所述微卫星标记位点，其中，α1为第一判定阈值且α1≥(高通测序深度×有效的高通量测序片段的比例/基因组上能检测到的微卫星标记位点数)×概率保证。

2.根据权利要求1所述的开发方法，其特征在于，α1≥20。

3.根据权利要求1所述的开发方法，其特征在于，每个所述探针的简单重复序列的重复次数为6～15。

4.根据权利要求1所述的开发方法，其特征在于，所述探针的序列如序列表中SEQ IDNO:1-SEQ ID NO:12所示。

5.一种权利要求1-4任一项所述的开发方法成功开发的微卫星标记位点内的微卫星标记的长度检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：

从成功开发的所述微卫星标记位点中，选择待检测的微卫星标记位点，所述从成功开发的所述微卫星标记位点中，选择待检测的微卫星标记位点的方法包括：

选择所述待检测的微卫星标记位点的标准为H值最大的所述微卫星标记位点，其中，H值为所述微卫星标记位点的多态性指数，其中，S为微卫星标记位点按有效的高通量测序片段中的微卫星标记的长度分类的数目，i为按所述微卫星标记位点的所述有效的高通量测序片段中的微卫星标记的长度进行分类时，第i个类别，i为自然数；ai为第i个类别的有效的高通量测序片段的数目占总的有效的高通量测序片段的数目的比例，利用多重扩增引物扩增所述待检测的微卫星标记位点内的微卫星标记，得到扩增产物，将所述扩增产物进行高通量测序，得到第二高通量测序片段，通过分析所述第二高通量测序片段，获得所述微卫星标记位点内的微卫星标记的长度，获得所述微卫星标记位点内的所述微卫星标记的长度的方法为：去除所述第二高通量测序片段中的所述微卫星标记后，获得所述第二高通量测序片段的左边界序列和所述第二高通量测序片段的右边界序列；利用所述左边界序列和所述右边界序列将所述第二高通量测序片段中的每个片段比对到所述待检测的微卫星标记位点上；截取每一个所述待检测的微卫星标记位点的所述第二高通量测序片段中的所述微卫星标记；将获得的所述微卫星标记按长度进行分类，并计算第i个类别的真实度R_i＝N_i/N_max，其中，i为按所述微卫星标记位点的所述有效的高通量测序片段中的微卫星标记的长度进行分类时，第i个类别，N_i为所述第i个类别的所述第二高通量测序片段的数量，N_max为所有类别的所述第二高通量测序片段的数量的最大值；若所述真实度R_i≥α4，则所述第i个类别的所述微卫星标记的长度为所述微卫星标记位点内的所述微卫星标记的长度，若所述真实度R_iα4，则所述第i个类别的微卫星标记的长度不为所述微卫星标记位点内的所述微卫星标记的长度，其中，α4为第四判定阈值且α4＝0.15；

制备所述多重扩增引物的方法包括：

从选择的所述待检测的微卫星标记位点的所有所述有效的高通量测序片段中，提取所述微卫星标记并挑选出最长的所述微卫星标记作为多重扩增引物的模版序列的微卫星标记；

从选择的所述待检测的微卫星标记位点的所有所述有效的高通量测序片段中，提取所述微卫星标记的左侧序列并挑出长度大于α2个碱基的所有序列，从挑选出的所述所有序列中，挑选出频率最高的序列，以所述频率最高的序列作为参考序列，将所述参考序列与所有的所述微卫星标记的左侧序列进行比对，在所述频率最高的序列中获得每一个碱基的覆盖倍数和变异频率；在所述频率最高的序列中，将所述覆盖倍数≤1/α3或所述变异频率≥α3的碱基变为N后作为所述多重扩增引物的模板序列的左侧序列，其中，N为A、T、C和G四种碱基中任意一种及以上的碱基；α2为第二判定阈值，α2＝(所述第一高通量测序片段的平均长度-所述多重扩增引物的微卫星标记位点的长度)÷2；α3为第三判定阈值，α3≥5×(1-所述第一高通量测序片段的准确度)；

按照与所述多重扩增引物的模板序列的左侧序列相同的方法，获得多重扩增引物序列的模板序列的右侧序列；

将所述多重扩增引物的模板序列的左侧序列、所述多重扩增引物的模板序列的微卫星标记和所述多重扩增引物的模板序列的右侧序列依次连接，得到所述微卫星标记位点的多重扩增引物的模板序列，利用所述微卫星标记位点的多重扩增引物的模板序列，获得所述多重扩增引物。