[发明专利]筛选基因编辑产物的方法

说明书

本发明公开了一种ACT‑PCR筛选基因编辑产物的方法，包括如下步骤：1)、提取野生型及待测样品的基因组DNA；2)、设计引物：使正向引物FA的3’末端跨过基因编辑拟切割位点；反向引物RA是以目标基因的基因组序列为参照，位于互补链的下游，反向引物RA的Tm值不低于正向引物FA；3)、获得最大临界退火温度T_am和最小临界退火温度T_lm；4)、利用引物对FA/RA以基因组DNA为模板、设定退火温为T_lm<Tm≤T_am之间，进行PCR扩增；5)、将扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离；能够扩增出目的条带所对应的样品为野生型或者杂合突变体；不能扩增出目的条带所对应的样品为纯合突变体。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用ACT-PCR筛选基因编辑产物的方法与应用。

背景技术

近年来，利用ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9、Cpf1、Ago等基因编辑系统，在多个物种中成功实现了基因组的定点编辑。这些系统可对基因组中特定的DNA序列进行精细改造，在特定位置敲除或者插入基因。利用这些系统进行基因组编辑会产生大量的突变体，因此鉴定这些突变体的工作量巨大。而目前对基因编辑突变体的筛选主要有以下几种方法：PCR酶切(PCR/RE)检测法，T7EI酶切法，高分辨率溶解曲线分析法等。这些方法在实际应用中存在一定缺陷：PCR/RE检测法只适用于编辑位点处存在限制性内切酶切点的靶序列，这个条件限制了靶序列的选择；T7EI酶切法适合鉴定杂合突变体，但对纯合突变体的鉴定相对繁琐，不利于实际应用；利用高分辨率溶解曲线分析法需要昂贵的仪器。这些鉴定方法限制了大规模高通量地筛选基因编辑后产生的突变体。与此同时，目前鉴定通过基因编辑的方法得到的混合细胞系主要用的PCR/RE和T7EI酶切法，并不能精确定量细胞系中的突变效率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种ACT-PCR筛选基因编辑产物(突变体)的方法，采用本发明的方法能简单、快捷、廉价、高通量地鉴定基因编辑产物(突变体)。在此基础上结合实时荧光定量PCR技术，还可以精确定量细胞系中的突变效率。

本发明利用PCR反应程序中，退火温度决定引物与模板结合效率的特点，根据野生型序列，在突变位点附近设计特异正向引物及退火温度略高于正向引物的反向引物，在严格的退火温度范围内，通过常规PCR反应来鉴定基因编辑突变体。其中，由于特异的正向引物与突变体模板不能完全匹配，在严格的退火温度下不能进行有效扩增，因此不能扩增得到PCR产物的样品即为突变序列。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种ACT-PCR筛选基因编辑产物的方法，包括如下步骤：

1)、提取野生型及待测样品的基因组DNA，以获得PCR模板；

备注说明：待测样品是以野生型为背景材料，基因编辑后得到的待鉴定材料；

2)、引物设计：

以目标基因的基因组序列为参照，设计ACT-PCR正向引物FA，使正向引物FA的3’末端跨过基因编辑拟切割位点；反向引物RA是以目标基因的基因组序列为参照，位于互补链的下游(位于正向引物下游)，设计反向引物RA的Tm值不低于正向引物FA；设计策略如图1所示。

3)、利用步骤2)的引物对FA/RA以野生型基因组DNA为模板进行退火温度梯度PCR扩增；将所得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离；

能够扩增出目的条带所对应的最高温度为临界退火温度T_am；

模型如图2所示，其中第8点样孔所对应的T_m即为临界退火温度T_am，作为后续的ACT-PCR退火温度。

利用步骤2)的引物对FA/RA以已知突变体基因组DNA为模板进行退火温度梯度PCR扩增；将所得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离；