[发明专利]酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法

说明书

本发明公开了一种酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法，该方法包括步骤：(1)利用GshF酶和Adk酶在反应罐中生成谷胱甘肽和腺苷酸；(2)在反应罐中分离固定化的GshF和Adk酶，或使用过滤设备分离游离的GshF酶和Adk酶；以及(3)分离产物GSH及AMP。本发明的制备方法优化了GSH生产的反应条件，使GSH生成浓度达到30‑50g/L，氨基酸利用率也较高；同时，使用Adk酶对反应中消耗的ATP进行部分再生，降低了ATP的消耗量；且本发明的方法能同时制备GSH和AMP。

技术领域

本发明涉及谷胱甘肽的制备方法，特别涉及一种酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法。

背景技术

谷胱甘肽广泛存在于动植物和微生物中，是生物体内最重要的非蛋白巯基化合物之一，具有还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，生物体内大量存在并起主要作用的是GSH，广泛用于治疗肝脏疾病、肿瘤、氧中毒、衰老和内分泌疾病，并作为生物活性添加剂及抗氧化剂用于食品领域。

GSH由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)经肽键缩合而成的三肽。相对分子质量为307.32，等电点为5.93，常温下为白色晶体，易溶于水、低浓度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺。

目前谷胱甘肽的主要制备方法有：溶剂萃取法、化学合成法、生物发酵法和酶法。从谷物胚芽中提取GSH，由于GSH得率低、成本高、有机溶剂污染严重、纯度不高，而且消耗大量粮食，现已较少使用。化学合成法合成GSH，由于活性产物不易分离，需要化学拆分，产品纯度不高，难以推广。目前国内外GSH生产基本采用发酵法，原理是将编码GSH合成酶系的基因克隆到大肠杆菌或酵母中，使用微生物发酵生产GSH。酵母发酵法，工艺较成熟，但生产周期长，产量偏低，且过多的副产物使下游工艺处理复杂。

近年来酶法生产GSH技术逐步提高，使大规模生产变为可能。经典的酶法生产GSH依赖于γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gsh I)和谷胱甘肽合成酶(Gsh II)两种酶，Gsh I催化L-谷氨酸和L-半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸，Gsh II催化γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成GSH。在GSH合成过程中，由于Gsh I催化过程受到终产物GSH的反馈抑制，因此使生成γ-谷氨酰半胱氨酸的第一步反应成为整个GSH合成的限速步骤。

随着进一步研究，人们在单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)等十几种细菌中都发现了一种双功能谷胱甘肽合成酶(GshF酶)。该酶同时具有Gsh I与Gsh II的活性，可一步催化GSH合成，且该酶反馈抑制作用较小，非常适和应用于酶法合成谷胱甘肽。

酶法合成GSH的最大问题是三磷酸腺苷(ATP)的大量消耗，生产1kg GSH至少需使用3-5kg的ATP，成本过高。为了解决这方面的问题，可使用酵母糖酵解再生ATP的方法与之偶联，专利CN201210201691.2中使用该方法再生ATP，效果稳定。但使用酵母会在反应体系中引入色素等杂质，给进一步纯化增加难度，使用酶系再生ATP是近年来的研究方向。此外，专利CN201510762184.X中使用多聚磷酸盐酶系再生ATP，取得了很好的效果。该酶系包含多聚磷酸盐激酶(Ppk)、腺苷酸激酶(Adk)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(Pap)。其中，Ppk与Pap酶在反应过程需添加多聚磷酸盐，对GSH反应转化率、能达到的最大浓度及后期纯化均有影响。因此，如何使用Adk酶优化GSH的生产，降低ATP的使用量，且在保证产物GSH易于纯化及分离的基础上，能同时制备得到其它有经济效益的产物，如腺苷酸(AMP)，成为目前的研究重点。

发明内容

本发明提供了一种酶法同时制备谷胱甘肽(GSH)和腺苷酸(AMP)的方法，从而克服现有技术的上述缺陷。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法，该方法包括以下步骤：