[发明专利]超级细菌Steno荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种超级细菌Steno荧光定量PCR检测用引物及探针，其正向引物序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；探针序列如SEQ ID NO.3所示；所述探针的5′端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。本发明还公开了超级细菌Steno的检测试剂盒和检测方法。本发明针对超级细菌Steno设计了特异性引物和荧光探针，提高检测敏感性和特异性，假阳性低；本发明的检测试剂盒检测灵敏度高，特异性好。

技术领域

本发明涉及一种超级细菌Steno荧光定量PCR检测试剂盒，属于细菌分子生物学检测技术领域。

背景技术

“超级细菌”(super bacteria)是指一些绝大多数高效抗菌素都战胜不了的耐药细菌。当人体被这种“超级细菌”感染后，医疗上往往治疗棘手，选择有效抗菌素困难。“超级细菌”容易在医疗卫生机构中传播，其后果常导致患者死亡，因而引发对“超级细菌”的恐慌和不安。近年来随着抗菌药物、抗肿瘤化疗药物及免疫抑制剂的广泛使用，全球的细菌耐药情况日趋严峻，目前感染病专家们认为的“超级耐药细菌”主要有：耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐万古霉素的葡萄球菌(VRSA)、耐万古霉素的肠球菌(VRE)、耐碳青霉烯类的肠杆菌科细菌(包括NDM-1)、多重耐药的铜绿假单胞菌(MDR-PA)、泛耐药的鲍曼不动杆菌(PDR-AB)、产超广谱β内酰胺酶(ESBL)的肠杆菌科细菌、多重耐药的结核杆菌(XTB)等。

嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas mahophilia，Steno)是一种严格的非发酵型需氧的革兰氏阴性杆菌，广泛分布于水、土壤、植物根系、人和动物的体表与消化道中，在自然界中的河水、污水及自来水中常可检出，也可以从正常人口、咽部、痰、粪便中检出。过去一般认为该菌的毒力较弱，对人和其他动物的致病性不强，但近10年来发现Steno感染所致的疾病的发病率逐年增高，已成为人类重要的条件致病菌和重要的医院内感染菌，在医院病人中的分离率在非发酵型革兰氏阴性杆菌中，仅次于铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)和不动杆菌而居第三位，其感染可致肺炎、败血症、脑炎、心内膜炎、化脓性淋巴结炎和脓肿。Steno感染的死亡率高达43％以上，引起如此高的死亡率的主要原因是由于该菌能产生多种蛋白酶、核酸酶、透明质酸酶等胞外蛋白致病因子，以及β-内酰胺酶等，具有多重耐药性，导致其对目前大多数的抗菌药物不敏感所致；其次是该菌对一些最初敏感的抗菌药物往往在治疗过程中很快会产生耐药，从而导致治疗的失败，引起死亡，这给该菌感染的治疗带来很大的困难。因此，加强对该菌耐药性的监测，尽早检测和发现致病菌，有助于在临床治疗上更为有效、合理的选择药物，为制定更为科学、合理的防治措施提供科学的理论依据。

目前对超级细菌Steno的检测尚缺乏有效的方法，API20NE鉴定系统等传统的培养鉴定法耗时长且缺乏敏感性和特异性；常规PCR的操作过程较烦琐，包括增菌、扩增、电泳等步骤，既费时又易污染而导致假阳性的发生。

实时荧光定量PCR技术(rea1-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，它是一种在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任一一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。