[发明专利]一种牦牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法及其试剂盒

说明书

本发明涉及基因多态性检测技术领域，具体涉及一种牦牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法及其试剂盒，包括以下步骤：步骤一：制备牦牛FOXO1基因扩增产物；步骤二：合成高低温内标；步骤三：制备HRM‑PCR扩增产物；步骤四：收集荧光信号。本发明所设计的基因探针比现有技术中的HRM法检测多态性位点定位更加准确、灵敏，且分型准确不需要PCR后处理，工作效率高、重复性好对样本的质和量要求不高，尤其对DNA模板的浓度要求可低至0.1ng/μL，尤其样本量大时，既省时又省力。同时本发明检测试剂盒敏感度高，检测快速，稳定性好。

技术领域

本发明涉及基因多态性检测技术领域，具体涉及一种牦牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法及其试剂盒。

背景技术

FOXO1是FOXO家族的成员之一，作为转录因子，其通过翻译后修饰等方式调节下游靶基因转录，参与氧化应激、凋亡、DNA损伤修复、细胞周期阻滞等生物学过程，。目前FOXO1基因作用机制尚未完全阐明，针对FOXO1基因研究已成为当今研究热点。对FOXO1基因进行定性分析有助于对FOXO1基因的进一步研究。

单核苷酸多态性(SNP)是基因组中发生频率最高的变异种类。研究SNP可促进人们对基因组结构、基因的进化历史及疾病发生根源的了解。SNP是种群遗传分析、疾病发生机理和药物研发等领域的重要研究对象。目前，针对SNP研究所建立的数据库和高效、精确、方便操作的工具，对于展现SNP在引领遗传分析、疾病诊治等领域发展方面的重要性具有很高的利用价值。

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是指相同或不同物种个体的基因组DNA序列同一位置上的单个核苷酸存在差别的现象。其中多态性(polymorphism)指的是形态多样性和状态多样性，在这里是基因水平上的多态性，指一个基因座位上存在多个等位基因，它是基因组中发生频率最高的点突变，在已知DNA的多态性中占了大约90％。同时，也发现每1000个碱基中就有一个会发生变异，它在一个种群中的发生率至少在1％水平。因此，具体地说，SNP指的是基因组序列中单核苷酸(A、T、C和G)改变时所发生的DNA序列的多态性变化，即基因组内特定的核苷酸位置上存在2种或更多不同的碱基，其中最少一种在群体中的频率不低于1％。

多态性(SNP)位点的经典方法是一大类以凝胶电泳为基础的一系列传统方法，包括：限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)，此方法应用的前提是SNP位点必须含有限制性内切酶的识别位点，但此方法是SNP位点筛查中最经典的方法之一；单链构象多态性法(PCR-SSCP)，该方法简单快速，被广泛运用与未知基因突变的检测，但这种方法对温度要求严格且不能确定突变的类型及突变的具体位置，因而带有一定的盲目性。变性梯度凝胶电泳(DGGE)，多用于分析自然环境中细菌类和、真核生物和病毒等生物的多样性。此方法具有可重复和操作简单等特点,但此法会受到DNA分子互补链中氢键的含量的影响，因此很少用于SNP位点的检测分析；等位基因特异性PCR法(ASPCR)。

而现有的一些新型SNPs高通量检测方法包括：高效液相色谱法(DHPLC)法；基因芯片法及DNA直接测序法。其中DHPLC法检测效率高便于自动化的优点，且准确率高，但DHPLC对所用试剂和环境要求高，易产生误差。基因芯片法具有信息量大、自动化程度高的特点，但芯片造价成本昂贵，所需设备贵重，所以不利于普及应用。而DNA直接测序法突变位点检出率高、速度快，摆脱了传统的凝胶电泳所对温度的要求，且对其类型和位置分析准确，带有目的性，成本相对低，利于广泛应用于检测SNP位点。