[发明专利]一种牦牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种牦牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：制备牦牛FOXO1基因扩增产物：首先提取牦牛血液基因组DNA，将其稀释后，以基因组DNA为模版，以牦牛FOXO1基因序列设计特异性引物对A和特异性引物对B，进行PCR扩增牦牛FOXO1基因，得到PCR扩增产物后纯化；取纯化后PCR扩增产物测序，找出单核苷酸位点；

步骤二：合成高低温内标：通过高分辨率熔解曲线分析牦牛FOXO1基因单核苷酸多态位点的DNA探针，进行基因型分析，合成高低温内标，并对熔解曲线进行校正；

步骤三：制备HRM-PCR扩增产物：取FOXO1基因的基因组DNA，加入步骤二所述的牦牛FOXO1基因单核苷酸多态位点的DNA探针，进行HRM-PCR扩增，得到HRM-PCR扩增产物；

步骤四：收集荧光信号：将步骤二合成的高低温内标稀释，并与步骤三制备的HRM-PCR扩增产物混合，于高分辨率熔解曲线分析系统中收集荧光信号，通过不同的荧光检测结果确定检测SNP位点处碱基突变的基因型；

所述特异性引物对A为：

上游引物：5′AGAGGGAGGCAAGAGTGG 3'；

下游引物：5′ATGTCGTTGTGCGGAGGA 3'；

所述特异性引物对B为：

上游引物：5′ATCCAGAGGGAGGCAAGA 3'；

下游引物：5′GGACAGACTAGGCAGAGTAGAA 3'；

所述步骤二中的牦牛FOXO1基因单核苷酸多态位点的DNA探针列为：针对FOXO1基因720C/T位点的上游探针：5′CCCTGCTACTCCTTTGC 3′；针对FOXO1基因720C/T位点的下游探针：5′CATGCCTCCATAACTCG 3′。

2.根据权利要求1所述的一种牦牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述特异性引物对A扩增长度为702bp，其PCR扩增位置为165-866，所述特异性引物对B扩增长度为371bp，其PCR扩增位置为161-531。

3.根据权利要求1所述的一种牦牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min，94℃变性30s，复性30s，特异性引物对A的PCR扩增退火温度为61℃，特异性引物对B的PCR扩增退火温度为62℃，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

4.根据权利要求1所述的一种牦牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述步骤三的HRM-PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性20s，复性20S退火温度55℃，72℃延伸20s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

5.根据权利要求1所述的一种牦牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述步骤四中的高低温内标稀释的方法包括以下步骤：1OD内标单链加400μL双蒸水，退火体系为：饱和氯化钠1μL,内标互补双链各1μL，补水至10μL，95℃水浴3min，温度降至室温，得到稀释后的高低温内标。

6.根据权利要求5所述的一种牦牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述高低温内标的核苷酸序列为：

退火温度为57℃的低温I内标：5'GTATTATATTTATATATATATAATTAATATTATAAATATTTTATAATTTAA-C3-3'；

退火温度为53℃的低温II内标：5'TTAAATTATAAAATATTTATAATATTAATTAATATATAAATATAATAC-C3-3'；

退火温度为86℃的高温I内标：5'GCCCGCCCCTCCGCTTCCGCACCTCCAGCAGCCGCTCAGAGTCTCGGGTCAGTGCCGGCCGCGC-C3-3'；

退火温度为86℃的高温II内标：5'GCGCGGCCGGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGAGGTGCGGAAGCGGAGGGGCGGGC-C3-3'。