[发明专利]一种特定基因片段的DNA甲基化检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物(人、动物等)样品全基因组中特定基因片段的DNA甲基化水平检测方法。

背景技术

特定基因的DNA甲基化定量分析对癌症研究和诊断具有重要的意义，结合亚硫酸氢盐处理的测序法(BisulfitesequencingPCR,BSP)被公认为是甲基化分析的金标准。该方法的基本过程是：DNA经亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，经PCR扩增，甲基化的胞嘧啶扩增为鸟嘌呤，而尿嘧啶扩增为胸腺嘧啶。对PCR产物进行克隆后测序，通过与基因库的序列比较和数据统计分析，可判断CpG位点是否发生甲基化及甲基化程度的信息。此方法是一种可靠性及准确度均较高的方法，既可以获得特定基因的甲基化位点，又可以获得该基因的甲基化定量的数据。但该分析方法周期长，扩增出PCR产物后，经转染质粒和大肠杆菌培养，挑选质粒测序，分析一个样品约需3-7天的时间。为了获得离散性较小的分析结果，需要较多数量的克隆测序(一般≥10个克隆)，否则会因挑选克隆的不同，分析结果差异大，然而大量克隆测序会带来巨大的工作量和高昂的费用，因而影响了该方法的推广应用。

Herman等人提出的甲基化特异PCR(Methylation-specificPCR，MSP)是目前应用较广的一种特定区域DNA甲基化检测技术，可以检测多个CpG位点的甲基化情况。该方法以亚硫酸氢盐处理后的DNA产物作模板，加入甲基化特异性的引物或未甲基化的引物进行特异性的扩增检测。若用甲基化特异性引物能扩增片段，说明该检测位点发生了甲基化；若用未甲基化引物能扩增出片段，说明该检测位点未甲基化。该方法分析过程相对简单，灵敏度较高。但存在明显的不足：①如果亚硫酸氢盐对DNA处理不完全,易导致假阳性；②MSP法是以引物中所有CpG位点胞嘧啶均完全甲基化或完全未甲基化为前提设计的,而事实上CpG岛的CpG位点可能部分甲基化。所以MSP法常常存在目标片段难扩增，或者特异性差等问题。

除了MSP，还有甲基化敏感性高分辨率溶解曲线分析(methylation-sensitivehighresolutionmeltinganalysis，MS-HRM),甲基化敏感性限制性内切酶消化(methylation-sensitiverestrictendonucleasedigestion，MS-RED)和实时荧光定量PCR,单分子实时测序(single-moleculereal-timesequencing,SMRT)等方法相继被提出。这些方法均存在受基因片段长度和CpG位点的限制、低灵敏度、低准确度、半定量、成本高等不足，无法有效简便地对特定区域DNA甲基化进行准确定量。

由于其高灵敏度和准确度，质谱(MS)已被用于区域DNA甲基化检测，如联合甲基化敏感性限制性内切酶的质谱法(Combinationofmethylated-DNAprecipitationandmethylation-sensitiverestrictionenzymesandmassspectrometry，COMPARE-MS)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOF-MS)等方法相继被提出。但是，它们均为半定量方法，而且数据处理复杂，难以适用临床的常规检测应用。

因此，有必要对现有的特定基因片段的DNA甲基化水平的定量检测方法进行进一步的改进。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种特定基因片段的DNA甲基化检测方法，该方法可以实现快速、高效、准确地对特定基因片段的DNA甲基化水平进行定量检测。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种特定基因片段的DNA甲基化检测方法，其特征在于，采用质谱、光谱、电化学或荧光定量PCR技术直接测定裂解后的单个碱基或核苷含量，并通过公式计算样品中的DNA甲基化水平。

优选地，本发明按照以下步骤进行：

1)DNA提取和重亚硫酸盐处理；

2)特定基因片段的获取：以重亚硫酸盐处理后的基因组DNA为模板，采用聚合酶链式反应、即PCR技术扩增特定基因片段，并通过琼脂糖凝胶电泳切胶纯化特定基因片段的PCR产物；

3)基因DNA片段的裂解：将纯化后的特定基因片段的PCR产物和同位素内标准混合，采用甲酸进行裂解反应，使基因片段裂解成为单个碱基；