[发明专利]一种特定基因片段的DNA甲基化检测方法

权利要求书

1.一种特定基因片段的DNA甲基化检测方法，其特征在于，采用质谱、光谱、电化学或荧光定量PCR技术直接测定裂解后的单个碱基或核苷含量，并通过公式计算样品中的DNA甲基化水平。

2.根据权利要求1所述的一种特定基因片段的DNA甲基化检测方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

1)DNA提取和重亚硫酸盐处理；

2)特定基因片段的获取：以重亚硫酸盐处理后的基因组DNA为模板，采用聚合酶链式反应、即PCR技术扩增特定基因片段，并通过琼脂糖凝胶电泳切胶纯化特定基因片段的PCR产物；

3)基因DNA片段的裂解：将纯化后的特定基因片段的PCR产物和同位素内标准混合，采用甲酸进行裂解反应，使基因片段裂解成为单个碱基；

4)采用液相串联质谱LC-MS/MS检测单个碱基或核苷的含量；

5)特定基因片段DNA甲基化率的计算：采用公式计算目的基因片段的DNA甲基化率。

3.根据权利要求1所述的一种特定基因片段的DNA甲基化检测方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

1)DNA提取和重亚硫酸盐处理；

2)特定基因片段的获取：以重亚硫酸盐处理后的基因组DNA为模板，采用聚合酶链式反应、即PCR技术扩增特定基因片段，并通过琼脂糖凝胶电泳切胶纯化特定基因片段的PCR产物；

3)基因DNA片段的酶解：采用DNA裂解酶、碱性磷酸酶和核酸内切酶处理目的基因片段，得到单个核苷。

4)采用液相串联质谱LC-MS/MS检测单个核苷的含量；

5)特定基因片段DNA甲基化率的计算：采用公式计算目的基因片段的DNA甲基化率。

4.根据权利要求1、2或者3任一项所述的一种特定基因片段的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述液相串联质谱用于分离和检测DNA水解的碱基或核苷的含量。

5.根据权利要求1、2或者3任一项所述的一种特定基因片段的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述公式如下：

公式a：P_GuaCyt-M＝Q_GuaCyt-M/Q_Total-M

＝Q_Cyt-M×2/(Q_Cyt-M+Q_Ade-M)×2

＝Q_Cyt-M/(Q_Cyt-M+Q_Ade-M)

公式b：％Methylation＝(P_GuaCyt-M–P_gua-D)/P_Cyt-cpg-D×100％

其中：P_GuaCyt-M为LC-MS/MS法检测基因PCR产物中鸟嘌呤和Cyt或核苷占总碱基或核苷的百分比；Q_Cyt-M和Q_Ade-M为LC-MS/MS法检测基因PCR产物中Cyt和Ade或核苷的摩尔量；P_gua-D和P_Cyt-CpG-D分别为未经亚硫酸盐处理的原始目的片段序列中Gua和CpG位点中的Cyt或核苷占总体碱基的百分比。