[发明专利]一种人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法

说明书

本发明提供了一种人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括PCR反应液，且所述PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于扩增靶多核苷酸的上下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针。本发明所提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒具有很好的特异性，且操作快速、方法简便、灵敏度高，同时在反应体系中增加的内标能够有效防止检测呈假阴性。本发明所提供的人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒在提取DNA时使用核酸快速释放法，该法简便快速，无需加热。

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，更为具体地说，涉及一种人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一类分子量较小的无包膜的双链环状DNA病毒，专性侵染和寄生人体生殖器官及其它组织器官的上皮细胞。在临床上，根据HPV不同亚型致病力大小或致癌危险性大小不同可将HPV分为高危型和低危型两大类。低危型HPV主要引起肛门皮肤及男性外生殖器、女性大小阴唇、尿道口、阴道下段的外生性疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤。高危型HPV除可引起外生殖器疣外，更重要的是引起外生殖器癌、宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤变，其病毒亚型主要有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型。

HPV在人群中极易传播扩散，可通过直接或间接接触交叉传染，其感染部位隐蔽，发病隐匿，不易早期发现，可致多种增生性病变，在女性生殖系统所引起的最常见的恶性肿瘤为宫颈癌。对宫颈癌的病因学研究可知，高危HPV持续感染是子宫颈癌的主要致病因素，99.7％宫颈癌患者存在HPV感染。临床研究显示，从HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变并最终发展为宫颈癌大约需要8-10年，因此筛查是目前预防和早期诊断宫颈癌的主要手段。美国国立综合癌症网络(NCCN)宫颈癌筛查实践指南等明确指出，即使宫颈细胞学无异常而HPV阳性的30岁以上女性，如其为HPV16、HPV18感染者，应立即进行阴道镜检查。早期宫颈病变的治疗效果远比宫颈癌的治疗效果要好得多，且快速、准确的检测出HPV高危型的感染并同时分型鉴别HPV16、HPV18型对于早期治疗和降低宫颈癌的发病率和死亡率等具有重要的意义。

而目前在临床检测高危HPV-DNA的方法中，主要是采用基于实时荧光定量PCR(Polymerase Chain Reaction，即聚合酶链式反应)的技术及其改进。实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果，并得知样本浓度的定值结果。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。但是，仅有极少量荧光PCR诊断试剂盒在HPV诊断中使用，且缺乏完善的质控体系，操作比较繁琐，灵敏度不高，检测范围小，因此，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确快速诊断的需要。

国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测高危HPV-DNA的方法，这些试剂盒所提供的HPV-DNA提取方法主要是煮沸法，然而煮沸法存在很多不足之处：1)核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污染。2)检测灵敏度不高，约在10000copies/ml左右；3)没有设置阳性内对照(即内标)，无法监控假阴性；4)一般没有预防PCR产物污染的措施。

发明内容

本发明的目的是提供一种人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法，以解决背景技术所述的现有HPV检测方法灵敏度低的问题。