[发明专利]一种同时检测三种引起马铃薯块茎坏死的病毒的三重RT-PCR方法及其引物组合

权利要求书

1.一种同时检测三种引起马铃薯块茎坏死的病毒的三重RT-PCR方法，其特征在于，其步骤包括：

1）取马铃薯植株叶片或块茎，提取其RNA；

2）以步骤1）得到的RNA为模板，通过反转录，得到cDNA；

3）以步骤2）得到的cDNA为模板，用3对引物对其进行PCR扩增；

4）PCR产物凝胶电泳，根据目的片段大小及阳性对照，判断病毒感染情况；

其中，所述引物如下：

检测番茄斑萎病毒(TSWV)的引物为：正向引物如SEQIDNO.１所示；反向引物如SEQIDNO.２所示；

检测马铃薯Y病毒块茎坏死株系(PVY^NTN)的引物为：正向引物如SEQIDNO.３所示；反向引物如SEQIDNO.４所示；

检测马铃薯帚顶病毒(PMTV)的引物为：正向引物如SEQIDNO.５所示；反向引物如SEQIDNO.６所示。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：三重PCR检测的反应体系，按50μl计：10×PCRBuffer5uL、dNTPMixture4uL、模板4uL、3对引物的正向引物和反向引物各1uL、Taq酶1uL、补足ddH₂O至50uL。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于三重PCR检测的PCR程序：92℃预变性2min；92℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸1min；共40个循环；最后72℃延伸10min。

4.一种用于三重RT-PCR同时检测PVY^NTN、TSWV、PMTV三种病毒的引物对组合，其特征在于：其由三对引物组合而成，引物之间没有干扰，无非特异条带产生，所述引物分别如下：

检测番茄斑萎病毒的引物为：

正向引物如SEQIDNO.１所示；反向引物如SEQIDNO.２所示；

检测检测马铃薯Y病毒块茎坏死株系的引物为：

正向引物如SEQIDNO.３所示；反向引物如SEQIDNO.４所示；检测马铃薯帚顶病毒的引物为：

正向引物如SEQIDNO.5所示；反向引物如SEQIDNO.6所示。