[发明专利]在大肠杆菌中表达胶原酶的DNA分子、重组胶原酶的方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种胶原酶的DNA分子，及其在大肠杆菌中的表达、纯化重组胶原酶的方法及胶原酶在降解胶原蛋白方面的应用。

背景技术

胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理pH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。根据胶原酶的来源可分为动物胶原酶与微生物胶原酶。

其中，微生物胶原酶以底物范围广、酶切位点多、生产成本低等优点被广泛应用。目前已发现的可产生胶原酶的微生物主要分布于芽孢杆菌属，其中典型的类型有：梭状芽孢杆菌(Clostridiumhistolycum)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)等。但是由于这些微生物胶原酶是从微生物上清中提取的,成分复杂,有时可能还含有其它毒素,并且产量较低,因此,目前在应用中还存在不少问题。通过基因工程的手段大量生产微生物胶原酶可以克服这个问题。

目前，高纯度微生物胶原酶的生产制备工艺已成为国内外研究的热点，我国在微生物胶原酶的应用还处于刚起步阶段，由于高纯度胶原酶的提取工艺复杂，生产成本高，国内市场依赖大量高价进口胶原酶产品，限制了微生物胶原酶的应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种表达胶原酶的大肠杆菌及其构建方法与应用。

本发明的第一个目的在于提供一种蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus R75E(保藏编号为：CGMCC NO.8614)分泌的一种胶原酶的氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示)与核苷酸序列(如SEQ ID NO:2所示)。

本发明的第二个目的在于提供含有上述胶原酶基因在大肠杆菌中的表达 菌。

本发明的第三个目的在于提供一种纯化重组胶原酶的方法。

本发明的第四个目的在于提供上述胶原酶在降解胶原蛋白方面的应用。

为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

一种胶原酶蛋白质分子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种可编码胶原酶基因的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种含有所述可编码胶原酶基因的DNA分子的大肠杆菌重组表达载体，所述大肠杆菌重组表达载体为在pET28a质粒载体的多克隆位点插入所述的DNA分子得到的重组质粒。

所述大肠杆菌重组表达载体为在pET28a载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间插入所述DNA分子得到的重组质粒。

一种含有表达所述DNA分子的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是在宿主菌中导入所述的大肠杆菌重组表达载体得到的大肠杆菌菌株，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株；所述大肠杆菌重组菌是将上述DNA分子通过所述重组表达载体导入大肠杆菌中得到的大肠杆菌重组菌，该大肠杆菌重组菌命名为ColB-RZ1，保藏编号为CGMCC No.10684。

一种纯化所述重组胶原酶的方法，按照下述步骤进行：

(1)培养上述所得到的大肠杆菌重组菌ColB-RZ1，直至OD_600nm为0.6-0.8之间,向培养液中加入最终浓度为0.1mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，在22℃条件下振荡诱导培养16h；

(2)室温下收集大肠杆菌菌体，用超声破碎的方法将菌体破碎，将破碎后的裂解液离心，离心后对含有可溶性重组胶原酶的上清组分过滤除菌，得到无菌上清重组胶原酶液；