[发明专利]微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种低温葡萄糖氧化酶微生物发酵生产方法。

背景技术

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,E.C 1.1.3.4,简写为GOD)在有氧条件下专一性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢(Ahmed H等，Eur Biophys J，1998)。GOD主要分布于动物、植物和微生物体内，其中动、植物组织中GOD含量有限，而微生物由于其自身具有来源广泛、生长周期短等优点，是生产GOD的主要来源，目前，GOD的主要生产菌株为黑曲霉和青霉(王志新等，中国食品学报，2007)。早期GOD的生产主要从动、植物体内提取，但该方法很难得到纯度高的GOD,而微生物发酵法具有发酵生产工艺简单，提取步骤相对简易，酶的纯化工艺稳定，生产不受原料来源影响等特点，且生产的GOD在安全性方面具有更大优势，适用于批量生产，容易实现产业化，还可以与食品生产、饲料生产和医药检测材料联合在一起，具有广阔市场应用前景(邢良英等，食品科技，2007；张岳勋等，饲料工业，2011)。国外对GOD的研究比较早，主要在菌种筛选、产酶条件的优化、酶的分离纯化、酶学特性以及GOD基因的克隆与表达等方面都有深入研究(Sisak C等，Enzyme and Microbial Technology,2006；Mislovicova D等，Process Biochemistry,2007；)。相比国外，我国有关GOD的研究工作起步较晚(朱运平等，中国食品添加剂，2013)目前我国虽有GOD产品出售，但酶制剂纯度及活性普遍较低，稳定性差，生产成本较高，主要依赖进口(韩建春等，食品科学，2011)。低温GOD不仅可应用于食品工业、饲料行业、医药工业、纺织漂染等行业，在生物燃料、生物传感器及生物芯片等新兴领域也有广泛应用，因此具有非常广阔的开发潜力和应用前景。目前国内外未见低温GOD的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，该方法主要是微生物经过低温驯化后，在10～16℃液体发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，这种生产方法获得的低温葡萄糖氧化酶粗酶液活性可以达到227.1U/ml，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。

本发明所述的一种微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法具体包括以下步骤：

(1)将能产生葡萄糖氧化酶的菌种先活化，再经过逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温下稳定生长即驯化结束；该菌种的低温驯化培养基为：葡萄糖20.0～50.0g，蛋白胨1.0～5.0g，(NH₄)₂SO₄ 2.0～3.0g，CaCO₃ 1.0～5.0g，pH值为自然，于103kpa、121℃高压蒸气灭菌30min；

所述的能产生葡萄糖氧化酶的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种编号：1.3319或1.7760或1.3118；

(2)按常规方法将步骤(1)中低温驯化后的葡萄糖氧化酶产生菌在液体种子培养基中于10～16℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；所述的液体种子培养基为：蛋白胨7.0～12.0g,牛肉膏2.0～7.0g,NaCl 8.0～11.0g,pH值为自然,于103kpa、121℃高压蒸气灭菌30min。

(3)将液体二级种子按发酵液体积3～9％的接种量接入液体产酶培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶结束；所述的液体产酶培养基为：葡萄糖75.0～85.0g,蛋白胨1.0～5.0g,KH₂PO₄ 1.4～2.0g,MgSO₄·7H₂O 0.7～0.8g,KCl 0.2～0.6g,pH值为5.6,于103kpa、121℃高压蒸气灭菌30min。

(4)将(3)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的上清液即为粗酶液。

(5)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温葡萄糖氧化酶制剂。