[发明专利]基于链侵入的DNA扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过基于链侵入的DNA扩增检测产毒艰难梭菌(Clostridiumdifficile,C.difficile)的方法。本发明还涉及适用于该方法的寡核苷酸、组合物和试剂盒，以及它们用于检测产毒艰难梭菌的用途。

背景技术

梭菌属是革兰氏阳性、形成孢子的厌氧菌。致病的梭菌属菌种产生蛋白毒素，其中大的梭菌细胞毒素(LCT)的组由具有高体内毒性以及高结构和序列同源性的非常大的毒素组成(vonEichel-Streiberetal,1996)。艰难梭菌毒素A和毒素B是艰难梭菌致病性的主要原因。长期以来，毒素A被认为是主要的毒力因子，但是越来越多的证据表明，事实上毒素B在艰难梭菌感染中发挥主要作用(Lyrasetal,2009；Carteretal.,2012)。

艰难梭菌毒素A和B分别由基因tcdA和tcdB编码，所述基因位于～19.6kb的致病性基因座(PaLoc)中。所述PaLoc还包含两个调控基因，即tcdC和tcdR，它们分别充当毒素表达的负调控因子和正调控因子。也包括在PaLoc中的tcdE编码毒素A和B分泌必需的穿孔素(holin)样蛋白。在非产毒的菌株中，所述PaLoc被115bp的序列替换(Braunetal,1996)。DNA扩增已被用于检测产毒艰难梭菌菌株(Wrenetal,1990；McMillinetal,1991；McMillinetal,1992)。

一种依赖于上游引物、下游引物和链侵入系统的等温DNA扩增方法记载于WO2009/150467中。

发明内容

本发明涉及检测产毒艰难梭菌的靶核酸序列，以使得能够确定样品中产毒艰难梭菌的存在。本发明的方法使用上游引物、下游引物和链侵入寡核苷酸，每一种均包含与所述靶核酸序列互补的区域。组合起来，所述引物和链侵入寡核苷酸确保实现对所述靶核酸序列的扩增。所述链侵入寡核苷酸使至少一部分所述靶核酸序列成为单链，以允许结合所述上游引物和下游引物，从而允许DNA扩增。通常，在等温条件下进行所述扩增，而不需要进行双链DNA的热变性。

如果检测到所述靶核酸序列的扩增，这指示所述样品中存在靶病原体艰难梭菌的产毒菌株，不存在艰难梭菌的非产毒、非致病菌株或其他梭菌属(Clostridium)菌种。本发明人已证明，本发明的方法使得能够高度特异性和灵敏性地检测产毒艰难梭菌的不同靶核酸序列。

本发明提供了用于检测样品中的产毒艰难梭菌的靶核酸序列的方法，所述方法包括在促进所述靶核酸序列扩增的条件下使所述样品与至少一种上游引物、至少一种下游引物和至少一种链侵入寡核苷酸接触，其中每种所述引物和所述寡核苷酸包含与所述靶核酸序列互补的区域；并且其中所述链侵入寡核苷酸使得至少一部分所述靶核酸序列成为单链，以允许结合所述上游引物和下游引物。

本发明还提供了组合物和试剂盒，每一种均包括至少两种选自(a)上游引物、(b)下游引物和(c)链侵入寡核苷酸的寡核苷酸，其中：

-(I)所述上游引物是长度小于30个核苷酸的寡核苷酸，其包含SEQIDNO:2或其变体的序列；所述下游引物是长度小于30个核苷酸的寡核苷酸，其包含SEQIDNO:3或其变体的序列；所述链侵入寡核苷酸是长度大于30个核苷酸的寡核苷酸，其包含SEQIDNO:4或其变体的序列，并且在其3’区域还包含一个或多个经修饰的核苷酸；或

-(II)所述上游引物是长度小于30个核苷酸的寡核苷酸，其包含SEQIDNO:7或其变体的序列；所述下游引物是长度小于30个核苷酸的寡核苷酸，其包含SEQIDNO:8或其变体的序列；所述链侵入寡核苷酸是长度大于30个核苷酸的寡核苷酸，其包含SEQIDNO:9或其变体的序列，并且在其3’区域还包含一个或多个经修饰的核苷酸。

本发明还提供了每一种均如以上(I)中所定义的或每一种均如以上(II)中所定义的上游引物、下游引物和链侵入寡核苷酸在用于检测艰难梭菌的方法中的用途。

本发明额外地提供了用于诊断受试者中的艰难梭菌感染的方法，其包括在来自所述受试者的样品中实施本发明的检测产毒艰难梭菌的靶核酸序列的方法。

附图说明