[发明专利]一种用于转基因马铃薯检测的阳性标准质粒

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因马铃薯定性检测用标准质粒，具体涉及一种可检测转基因马铃薯的阳性标准质粒。

背景技术

转基因标准物质严重缺乏

随着转基因作物及相关产品在全世界范围内的迅速发展，其环境安全和食用安全问题一直受到各国政府和广大消费者及相关检测机构人员的重视。对转基因作物核酸进行监测、检测，并保证结果的准确、可靠和有效性，需要阳性标准物质的支撑。在保证转基因检测结果的可比性、溯源性，推进转基因产品检测方法标准化等方面，转基因生物标准物质发挥着十分重要的作用。

目前国外研制的转基因阳性标准物质的组织或企业主要是欧洲标准物质研究院(IRMM)和美国的油料化学学会(AOCS)。研制的种类主要包括转基因玉米、大豆、马铃薯、油菜、棉花、甜菜等50余种。但这与190多种转基因作物种类相比，还远远不够。我国目前已获的计量认证的转基因检测用标准物质不到10种，质粒阳性标准区区2种。因此，转基因阳性标准物质的研制和应用成为国内外农业转基因生物安全管理体系建设的当务之急，也是转基因检测监测的重要技术支撑之一。转基因标准物质的缺乏已成为制约转基因植物检测技术发展和检测机构建设的瓶颈问题之一。

转基因马铃薯问题广受关注

近几年，部分媒体及网络传言，“美国的土豆削皮、切丝后变黑，可是中国已经没有这样的土豆了。无论在云南还是北京买，土豆削皮切丝永远不会变色。基本上可以肯定，全中国城市出售的土豆都是转基因。”虽然，长期研究马铃薯种植技术的专家明确表示，中国没有转基因马铃薯，我国也从未批准进口转基因马铃薯，但长期以来，国内民众一直对转基因食品心存戒备，甚至到了谈转基因色变的地步。

目前，全球共批准商业化种植的转基因马铃薯31种，即将获批的转基因马铃薯2种，详见表1。国际上对转基因成分的检测主要是采用以核酸为基础的检测方法。关于转基因马铃薯，我国目前尚无用于检测的阳性标准物质，因而一定程度上阻碍了我国转基因马铃薯的检测工作进行。

转基因作物虽然多，但是绝大多数为跨国公司掌握的材料，国内检测机构很难取得，这就给检测带来了困难。阳性标准质粒的择优采用检测靶标基因片段，构建于质粒框架，用于转基因检测，解决了材料缺乏的问题。阳性标准质粒近几年已开始用于核酸检测领域，且具有易于富集，快捷高效等优点。如《耐除草剂转基因大豆质粒标准分子》(中国农业大学学报，2014)、《DAS-59122-7玉米的鉴定以及结合质粒标准品的品系特异性定量检测》(农业生物技术学报，2013)、《转cry1Ab基因棉花质粒标准分子的构建与分析》(中国生物防治学报，2013)、《转基因大豆MON89788质粒分子》(中国专利，专利号201010106138)等等。

本发明针对转基因马铃薯检测中因缺乏标准物质而产生的瓶颈问题，经过科学的调研、选择及克隆等步骤，发明了用于转基因马铃薯检测的阳性标准质粒，能筛选检测现行批准的所有转基因马铃薯(31)种，和即将获批的转基因马铃薯2种。此阳性标准质粒检测范围广，兼备性能稳定、易于制备、成本低等优点。

表1国际上转基因马铃薯信息汇总表

注：表中1～31在国际上已获批种植；32和33即将获批种植。

发明内容

本发明的目的是构建一种可作为检测转基因马铃薯的阳性标准质粒，在转基因马铃薯筛选检测时，用其作为阳性参照物质，可检测多种转基因马铃薯，达到覆盖面积广的目的。

本发明通过调研国际转基因马铃薯的功能基因、元件信息、筛选标记等分子特征，得到了可以全面覆盖国际上已获批转化体的组合元件，包括抗马铃薯甲虫基因Cry3A、胭脂碱合成酶启动子P-nos、抗马铃薯Y病毒基因PVYCP等3个外源基因；还确定了内标准基因尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase。

上述外源插入基因和内标准基因的序列号及所含核苷酸片段如表2所示：

表2外源插入基因和内标准基因的序列号、引物号

因此，本发明的技术方案是：

一种用于转基因马铃薯定性检测的阳性标准质粒，含有SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3分别所示的3个外源插入核苷酸片段，且含有SEQ ID NO:4的1个内标准基因核苷酸片段。

本发明经过PCR扩增验证，结果证明上述构建的阳性标准质粒可作为转基因马铃薯筛选检测时阳性对照品。

该阳性标准质粒可在转基因马铃薯定性筛选检测时作为阳性对照物质，解决了阳性标准品的缺乏问题。