[发明专利]利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物抗病性鉴定方法，特别是涉及一种利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片鉴定抗病性的方法，属于生物工程领域。 

背景技术

葡萄白粉菌是严重危害葡萄生产的重要真菌病害之一。目前广泛栽培的欧洲葡萄极易感病，严重影响到葡萄的产量和品质。传统的化学防治方法虽有效果，但因其残留高，污染重，严重影响葡萄产品的食用安全，威胁人体健康，污染生态环境，使其应用受到限制。生产实践表明，防治葡萄白粉病最经济、有效、环保的措施就是选育抗病品种,所以抗性鉴定自然成为抗源挖掘利用、抗病育种及抗性监测等工作中重要的一环。 

长期以来，葡萄育种者从国内外广泛收集了大量葡萄种质资源，并对其进行了抗病性鉴定。经大量研究表明，利用抗病性鉴定的有效方法，科学、准确、快速地鉴定葡萄种质资源对白粉病的抗性程度，是提高抗病育种效率、加速育种进程的关键环节。 

目前葡萄白粉病抗性鉴定方法主要有两种，一种是田间自然发病鉴定法；第二种是室内人工喷雾接种鉴定法，田间自然发病鉴定是目前应用最广泛的方法，菌株来源于大田，其小种数量和种类多样性、代表性较好，故鉴定结果较能准确反映当地当时的实际情况，具有成本低、操作简便易行的特点，缺点是对气候、季节依赖性强，鉴定次数少，重复性差。室内人工喷雾接种鉴定法是目前常用的人工接种方法，优点是通过人工控制葡萄白粉菌发病条件，可不受田间季节的限制而常年进行试验，结果快速，缺点是喷雾接种的浓度控制困难，接种用菌株的收集、保存与合理选择是长期、连续的工作，并且接种用的小种数量、种类的多样性与田间试验方法相比具有一定局限性。同时以上两种方法的共同不足是需要辅助材料较 多，鉴定周期较长，如需要明显观察到病斑，然后才能根据病斑大小统计病情指数，而这个过程至少需要15-20天，甚至更长时间，这极大地影响了葡萄种质资源大规模鉴定利用的速度和效率，从而影响到葡萄育种进程。因此，进一步开发科学、准确、快速地鉴定葡萄种质资源白粉病抗性的方法，无论是对加速葡萄抗病育种的实践，还是对丰富葡萄与病原菌互作的理论，都具有十分重要的意义。 

发明内容

本发明的目的在于克服目前田间自然发病鉴定法与室内人工喷雾接种鉴定法鉴定葡萄白粉病抗性所存在的缺陷，而公开一种利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

a.葡萄白粉菌菌株小种分离与纯化 

在葡萄白粉病发病盛期，在葡萄园采集严重感染葡萄白粉菌的叶片，采用单孢分离法，从采摘的病叶经分离纯化获得葡萄白粉菌，并对分离的葡萄白粉菌菌株进行致病性鉴定，选择其中一个菌株感病迅速，致病性强，符合鉴定需要，即为鉴定用葡萄白粉菌菌株小种； 

b.葡萄白粉菌菌株小种侵染 

采用压片接种法，用保存的新鲜白粉菌菌株小种接种葡萄健康叶片，检测菌株小种对葡萄的侵染过程； 

c.葡萄白粉菌菌株小种rDNA序列扩增 

收集菌株小种纯化后的白粉菌分生孢子，提取该白粉菌基因组DNA，用白粉菌保守区通用引物ITS4和NS7进行PCR扩增，得到菌株小种保守区DNA片段序列； 

d.葡萄白粉菌菌株小种进化分析 

用葡萄白粉菌菌株小种保守区DNA片段序列在NCBI进行序列比对及进化分析，表明获得了一个新的葡萄白粉菌菌株； 

e.葡萄白粉菌菌株小种保存与扩繁 

采用直接扫落接种在盆栽葡萄叶片上，摩擦接种插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片和喷洒接种插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片三种保存方法，对葡萄白粉菌菌株小种进行保存与扩繁； 

f.用葡萄白粉菌菌株小种接种葡萄种质资源、葡萄杂交后代及转基因葡萄植株离体叶片鉴定抗病性 

取葡萄种质资源、葡萄杂交后代及转基因葡萄植株离体叶片，压片接种葡萄白粉菌菌株小种，分别在接种后不同时间段采样，用台盼蓝染色，普通显微镜观察，通过统计孢子萌发及菌丝生长情况，检测葡萄对白粉病抗性。 

本发明保存扩繁的白粉菌产孢量大，孢子新鲜，致病性强，鉴定不需要较多辅助材料，周期短，操作简便，效果较好；利用本发明不但对开展大规模快速鉴定葡萄种质资源及其杂种后代和转基因葡萄植株抗病性具有直接参考价值，而且对开展相关其他植物抗病性鉴定，具有一定借鉴意义，也对加速作物抗病育种进程，提高育种效率，丰富作物与病原菌互作理论，提供重要支撑作用。 

附图说明

附图1为本发明葡萄白粉菌菌株NAFU1分离及侵染过程