[发明专利]利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法

权利要求书

1.利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法，其特征是通过以下技术方案实现的：

a.葡萄白粉菌菌株小种分离与纯化

在葡萄白粉病发病盛期，在葡萄园采集严重感染葡萄白粉菌的叶片，采用单孢分离法，从采摘的病叶经分离纯化获得葡萄白粉菌，并对分离的葡萄白粉菌菌株进行致病性鉴定，选择其中一个菌株感病迅速，致病性强，符合鉴定需要，即为鉴定用葡萄白粉菌菌株小种；

b.葡萄白粉菌菌株小种侵染

采用压片接种法，用保存的新鲜白粉菌菌株小种接种葡萄健康叶片，检测菌株小种对葡萄的侵染过程；

c.葡萄白粉菌菌株小种rDNA序列扩增

收集菌株小种纯化后的白粉菌分生孢子，提取该白粉菌基因组DNA，用白粉菌保守区通用引物ITS4和NS7进行PCR扩增，得到菌株小种保守区DNA片段序列；

d.葡萄白粉菌菌株小种进化分析

用葡萄白粉菌菌株小种保守区DNA片段序列在NCBI进行序列比对及进化分析，表明获得了一个新的葡萄白粉菌菌株；

e.葡萄白粉菌菌株小种保存与扩繁

采用直接扫落接种在盆栽葡萄叶片上，摩擦接种插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片和喷洒接种插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片三种保存方法，对葡萄白粉菌菌株小种进行保存与扩繁；

f.用葡萄白粉菌菌株小种接种葡萄种质资源、葡萄杂交后代及转基因葡萄植株离体叶片鉴定抗病性

取葡萄种质资源、葡萄杂交后代及转基因葡萄植株离体叶片，压片接种葡萄白粉菌菌株小种，分别在接种后不同时间段采样，用台盼蓝染色，普通显微镜观察，通过统计孢子萌发及菌丝生长情况，检测葡萄对白粉病抗性。

2.根据权利要求1所述的利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法，其特征是通过以下步骤用葡萄白粉菌菌株NAFU1接种大田栽植葡萄种质资源离体叶片鉴定抗病性：

a.葡萄白粉菌菌株NAFU1分离与纯化

在葡萄白粉病发病盛期，在发病严重的葡萄园采集感染葡萄白粉菌的叶片，置于冰壶中带回实验室，选取病原菌发病症状明显的新鲜病叶置于密封袋中，待其发病达到特别明显后，从感染白粉菌的病叶上扫落白粉菌到新鲜的葡萄叶片上，然后将接种后的葡萄叶片置于光照培养箱中，温度22±1℃，光照强度10000LX，相对湿度50-75％，10-15d后，得到单克隆菌落，待该白粉菌单克隆长到直径为1cm时，用小毛笔蘸取该单克隆菌落再接种到新鲜、干净的葡萄叶片上进行培养，10-15d后再次重复此过程，共重复五次这种单克隆菌落分离过程，将分离纯化获得葡萄白粉菌病原菌菌株编号，分别保存，经对上述分离的葡萄白粉菌菌株进行致病性鉴定，其中一个菌株感病迅速，致病性强，符合鉴定要求，遂将其保存扩繁，命名为NAFU1；

b.葡萄白粉菌菌株NAFU1侵染

为进一步检测NAFU1对葡萄的侵染过程，采用压片接种法，用保存的新鲜白粉菌接种移栽7周的葡萄组培苗健康叶片，在接种后1d、2d、3d、4d、5d、7d、10d采样，台盼蓝染色，普通显微镜下观察菌丝生长，NAFU1接种葡萄叶片1d，孢子仅膨大，但尚未萌发，接种葡萄叶片3d，孢子开始萌发，菌丝生长正常，接种葡萄叶片10d后，菌丝生长旺盛，遍布葡萄叶片，可以看见明显的附着孢，表明白粉菌生长良好，可以用于后续的快速检测；

c.葡萄白粉菌菌株NAFU1rDNA序列扩增

收集NAFU1纯化后的白粉菌分生孢子0.1-0.2g，置入1.5ml离心管中，常规CTAB法提取NAFU1基因组DNA，无菌水溶解DNA，以NAFU1基因组DNA为模板，用白粉菌保守区通用引物ITS4：5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3'和NS7：5'GAGGCAATAACAGGTCTGTGATGC3'进行PCR扩增，反应程序为：94℃3min，94℃30S，50℃30S，72℃1min，30个循环；72℃10min，4℃10min，高保真LA酶，扩增出一条800-1000bp单一条带，将扩增出的葡萄白粉菌DNA片段连接到pMD19-T克隆载体，提取质粒，将酶切鉴定正确的菌液送北京华大公司测序，得到葡萄白粉菌保守区DNA片段的序列；

d.葡萄白粉菌菌株NAFU1进化分析

将得到的葡萄白粉菌NAFU1保守区DNA片段的序列在NCBI进行序列比对，用MEGA5.0软件，构建进化树，分析葡萄白粉菌菌株NAFU1的进化关系，确认NAFU1是葡萄白粉菌，可以用于后续的快速检测；

e.葡萄白粉菌NAFU1保存与扩繁

对分离纯化得到的葡萄白粉菌NAFU1进行保存，先后尝试以下三种保存方法：

e.1直接接种在盆栽葡萄叶片上：取感病葡萄叶片，用刷子将白粉菌孢子扫到盆栽健康葡萄叶片上，置于光照培养箱中，温度22±1℃，光照强度10000LX，相对湿度50-75％，10-15d后，可见到明显的病斑；

e.2取离体葡萄叶片插于MS固体培养基中，用病叶摩擦接种离体叶片，然后置于光照培养箱中，温度22±1℃，光照强度10000LX，相对湿度50-75％，10-15天后，可见到明显的病斑；

e.3收集病叶，在无菌水中涮洗，将孢子溶于水中，喷洒接种于插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片，然后置于光照培养箱中，温度22±1℃，光照强度10000LX，相对湿度50-75％，15-20天后，可见到明显的病斑；

f.用葡萄白粉菌菌株NAFU1接种大田栽植葡萄种质资源离体叶片鉴定抗病性

取大田栽植葡萄种质资源离体叶片，压片接种葡萄白粉菌NAFU1，分别在接种后0，24，48和96h采样，将样品置于10ml离心管中，加入浓度为0.67mg/ml台盼蓝2ml，煮沸12min，冷却后，在离心管中加入水合氯醛3ml，静置24h后，倒去废液，重复三次，直到叶片蓝色褪去，然后用普通显微镜观察菌丝生长情况，刚接种时孢子尚未萌发，接种后24h，感病材料‘无核白’葡萄清晰可见菌丝生长，其余葡萄叶片上只见孢子萌发，未见明显菌丝，接种后48h，感病材料‘无核白’葡萄菌丝生长更加旺盛，感病野生葡萄株系白河-13可以看见明显的菌丝生长，但没有‘无核白’葡萄多，抗病葡萄如白河35-1菌丝更少，接种后96h，感病材料‘无核白’葡萄不但菌丝生长更加旺盛，而且可以看见明显、成熟的孢子梗，但抗病葡萄如白河35-1、通化-3叶片上菌丝较短，且出现明显的细胞坏死，表明植物抗病性出现，通过观察孢子萌发早晚、生长快慢、菌丝长短及有无细胞坏死出现等指标，可以快速、准确检测该葡萄的抗病性；