[发明专利]一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒、检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种鼠肝炎病毒复合型检测试剂盒和检测方法。

背景技术

鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV，学术上又称为Murinecoronavirus)属冠状病毒科，是一种核糖核酸(RNA)正向病毒，核酸由单股RNA构成，其大小因动物来源不同有些差别，一般直径约为80nm-160nm，有很多毒株型。根据鼠肝炎病毒嗜组织特性的不同，可将其分为呼吸株和嗜肠株两型。呼吸株病毒在易感动物的鼻腔上皮细胞内复制后，可向多种靶器官扩散，常见型病毒包括MHV-1、MHV-3、MHV-JHM、MHV-S和MHV-A59等。嗜肠株病毒选择性地感染小肠黏膜，极少扩散到其他组织，此型病毒包括MHV-Y、MHV-RI和DVIM等(殷震等，1997；A.W.Gledhill et al,2006；Homberger FR et al,1997；Norio Hirano et al,2013；Casebolt D B et al,1997)。鼠肝炎病毒包裹着由核衣壳蛋白N与单链基因组RNA复合体组成的核衣壳，膜上结合着三种结构糖蛋白，分别为刺突蛋白S、膜蛋白M和小分子外膜蛋白E。在嗜神经毒株MHV-JHM的被膜上还有血凝素酯酶HE。鼠肝炎病毒侵入宿主后，可以刺激机体产生抗体。

鼠肝炎病毒具有传染性强、传播途径复杂、感染过程多样化、流行面广泛、不易发现等特点。鼠肝炎病毒极易感染小鼠，严重鼠肝炎病毒感染可在数周之内摧毁小鼠群，并可能需要数年才能恢复。据在1982年血清流行病学调查，我国小鼠群中鼠肝炎的感染率为20％-100％(孙靖，2004)。

鼠肝炎病毒可以通过空气和直接接触传播，已感染鼠肝炎病毒鼠的排泄物和其污染的物品很容易感染健康鼠。鼠肝炎病毒也可垂直传播。小鼠一旦感染后，很难在种群中根除，因此鼠肝炎病毒的检测非常重要。目前，小鼠肝炎病毒呈世界性分布，在中国的小鼠群中广泛流行。通常情况下，鼠肝炎病毒感染小鼠后，多数带病毒小鼠呈隐性、亚临床或慢性感染，不易察觉，为鼠肝炎病毒的检测增加了难度。

由于鼠肝炎病毒侵入实验类鼠群后，会改变各种免疫应答参数，严重影响实验小鼠的质量和科学研究的准确性，不利于科学研究的开展。并且鼠肝炎病毒具有传染性强、传播途径复杂、感染过程多样化、流行面广泛、不易发现、危害严重等特点，因此快速、高效和方便的鼠肝炎检测病毒发法尤其重要。

目前，检测鼠肝炎病毒感染的依赖于血清学测定法，病理组织学，电子显微镜以及分子技术。目前市场上常用血清学检测方法有酶联免疫吸附试验和间接免疫荧光试验等，由于各株抗原的差异，虽实践中使用了多价抗原检测法，但依然对不同亚型的鼠肝炎病毒不能统一检测，仍需用不同的检测试剂，这样不仅花费大、耗时长，而且严重影响科学研究的正常进行。另外，近年来市场上使用的鼠肝炎病毒核酸检测盒，其主要方法是通过病毒核酸的反转录聚合酶链式反应来检测病毒类型的存在，该类检测盒虽可以在样本量很少的情况下进行鼠肝炎病毒检测，但因病毒核酸变异快，亚类型多，检测盒仅能检测部分病毒类型，由于反转录聚合酶链式反应所需探针的序列、敏感性及热循环程度等不同导致结果不同，导致检测阳性率低和假阳性的存在，所得结果仍需要相互确证。因此，有必要在本领域中建立快速，有效和可靠的监测和检测鼠肝炎病毒的方法。不仅对提高实验动物质量具有重要意义，同时对于新型冠状病毒的研究也会有一定的帮助。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的缺陷，提供一种克服单一的聚合酶链式反应(PCR)方法所存在的不能统一检测和假阳性率较高等问题，具有高度的特异性、灵敏性与准确性，且技术操作简便的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，该试剂盒含有：

(1)一步法反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂，其中包括无核糖核酸酶去离子水、焦磷酸核苷酸混合物、五倍反应缓冲液、酶混合液、磷酸盐缓冲液(PBS)、阳性对照品、阴性对照品、鼠肝炎病毒探针Ⅰ、探针Ⅱ、探针Ⅲ；

鼠肝炎病毒探针Ⅰ如序列表中的SEQ ID NO.1所示：5′-GAGGATTACCATACACTAAC-3′；

鼠肝炎病毒探针Ⅱ如序列表中的SEQ ID NO.2所示：5′-AAGGTAGACGGTGTTAGCGG-3′；

鼠肝炎病毒探针Ⅲ如序列表中的SEQ ID NO.3所示：5′-TTTAACCCGCGCTCGGTTTG-3′；