[发明专利]一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒、检测方法及应用

权利要求书

1.一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有： 

(1)一步法反转录聚合酶链式反应试剂，其中包括焦磷酸核苷酸混合物、五倍反应缓冲液、鼠肝炎病毒探针、无核糖核酸酶去离子水、酶混合液、磷酸盐缓冲液、阳性对照品和阴性对照品，所述鼠肝炎病毒探针包括鼠肝炎病毒探针Ⅰ、鼠肝炎病毒探针Ⅱ、鼠肝炎病毒探针Ⅲ； 

鼠肝炎病毒探针Ⅰ如序列表中的SEQ ID NO.1所示：5′-GAGGATTACCATACACTAAC-3′； 

鼠肝炎病毒探针Ⅱ如序列表中的SEQ ID NO.2所示：5′-AAGGTAGACGGTGTTAGCGG-3′； 

鼠肝炎病毒探针Ⅲ如序列表中的SEQ ID NO.3所示：5′-TTTAACCCGCGCTCGGTTTG-3′； 

(2)应用S2抗体的快速间接酶联免疫吸附技术检测试剂，其中包括应用S2抗体检测的阳性对照、应用S2抗体检测的阴性对照、S2抗体； 

应用S2抗体检测的阳性对照为经试验检测含有鼠肝炎病毒抗原蛋白S2的稀释液； 

应用S2抗体检测的阴性对照为经试验检测不含鼠肝炎病毒抗原蛋白S2的稀释液； 

S2抗体为抗原蛋白S2通过噬菌体抗体库筛选后生产获得的单克隆抗体； 

(3)应用抗原蛋白S2的快速双抗体夹心酶联免疫吸附技术检测试剂，其中包括应用抗原蛋白S2检测的阳性对照、应用抗原S2检测的阴性对照、S2蛋白稀释液； 

应用抗原蛋白S2检测的阳性对照为经试验检测含有鼠肝炎病毒S2抗体的稀释液； 

应用抗原蛋白S2检测的阴性对照为经试验检测不含鼠肝炎病毒S2抗体的稀释液； 

S2蛋白稀释液为溶于磷酸盐缓冲液中的S2抗原蛋白； 

(4)包被液； 

(5)洗涤液，包括洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ； 

(6)封闭液； 

(7)辣根过氧化物酶-蛋白A偶联物； 

(8)酶反应底物； 

(9)终止液； 

(10)脱氧核糖核酸酶Ⅰ； 

(11)肝素。 

2.根据权利要求1所述的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，所述鼠肝炎病毒探针选自鼠肝炎病毒核酸的共同恒定区序列。 

3.根据权利要求1所述的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，所述酶混合液含有莫洛尼氏鼠白血病毒反转录酶和脱氧核糖核酸聚合酶。 

4.根据权利要求1所述的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有鼠肝炎病毒核酸的样品稀释液；所述阴性对照品为不含有鼠肝炎病毒核酸的样品稀释液。 

5.根据权利要求1所述的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，所述S2蛋白基因序列选自鼠肝炎病毒目前流行的6种主要亚型的共同特有的结构蛋白S稳定区S2基因区域，并通过基因工程技术生物合成S2蛋白；所述6种主要亚型为MHV-1、MHV-2、MHV-3、JHM、A59和S。 

6.根据权利要求1所述的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，所述S2抗体通过噬菌体抗体库筛选技术和酶联免疫吸附技术制备。 

7.根据权利要求1所述的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶-蛋白A偶联物直接用于特异性抗体检测；所述辣根过氧化物酶-蛋白A偶联物由以下步骤制备： 

(1)溶解2毫克过氧化物酶于500μl去离子水中； 

(2)加入100μl新鲜制备的0.1M高碘酸钠，室温下避光搅拌20min； 

(3)将上述修饰后的酶化合物在1升1.0mM醋酸钠缓冲液中于4℃隔夜透析； 

(4)溶解2毫克蛋白A在500μl 10mM碳酸钠缓冲液，溶液pH为9.5； 

(5)通过加入250μl pH为9.5的0.2M的碳酸钠缓冲液调整透析后酶溶液pH为9.0-9.5，在室温下搅拌该混合物3小时； 

(6)加入50μl新鲜配制的4mg/ml硼氢化钠溶液，混匀后，4℃搅拌 2-3小时； 

(7)在1L磷酸盐缓冲液中透析上述溶液，透析6-16小时后更换新的磷酸盐缓冲液透析液继续透析6-16小时； 

(8)按照每1ml上述溶液加入5mg牛血清蛋白的比例添加牛血清蛋白，将溶液储存于-20℃；