[发明专利]一种受产物抑制减弱的环糊精葡萄糖基转移酶突变体

说明书

技术领域

本发明涉及一种受产物抑制减弱的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。 

背景技术

环糊精系淀粉及相关基质经酶解环合后得到的由六个以上葡萄糖经α-1,4-糖苷键连结而成的环状低聚化合物。在环糊精系列中，它们的命名是基于环中葡萄糖的数量，由6、7和8个葡萄糖单元组成的环糊精分别称为α-、β-和γ-环糊精。环糊精的立体结构是中空圆筒形，在它的圆筒内部有非极性的C3和C5上的氢以及通过醚键连接的氧原子，故圆筒内腔呈疏水性；而葡萄糖的C2和C3上的仲羟基位于圆筒的宽侧开口处，C6上的伯羟基位于圆筒的窄侧开口处，故圆筒外部呈亲水性。由于这种结构，使它具有容纳与其形状和大小适合的疏水性分子或基团嵌入圆筒内而形成包合物的特性，因此，在食品、医药、化工、农业、纺织等工业领域中有着广泛的应用。 

目前，环糊精的工业化生产均采用酶法合成，即在环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin Glycosyltransferase，简称CGT酶，EC 2.4.1.19)催化作用下，通过环化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精。由于野生CGT酶作用淀粉生产环糊精过程中，环糊精会与CGT酶蛋白分子发生结合，导致CGT酶的环化活力下降，出现由环糊精所引起的产物抑制现象，造成淀粉转化率相对偏低，环糊精生产成本居高不下，环糊精在工业中的应用受到极大的限制。 

本发明中所使用的来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01的β-CGT酶，环糊精产物对其环化活力有明显的抑制作用，因此，减弱产物抑制作用，提高环糊精得率，将有利于环糊精的工业化生产。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种受产物抑制减弱的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，即将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生CGT酶的第599位丙氨酸(Ala)突变为天冬酰胺(Asn)，得到单突变体A599N；或再将单突变体A599N的第633位酪氨酸(Tyr)突变为丙氨酸(Ala)，得到双突变体A599N/Y633A。 

编码所述野生CGT酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01。 

本发明的另一个目的是提供一种获得所述突变体A599N、A599N/Y633A的方法。根据B. circulans STB01野生CGT酶的基因序列，分别设计并合成引入A599N、A599N/Y633A密码子突变的引物，对基因进行定点突变，测定DNA序列，分别鉴别出编码突变体A599N、A599N/Y633A的基因，并在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。 

本发明的一种实施方式包括以下步骤： 

(1)定点突变 

单突变体A599N的定点突变：利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体为模板进行定点突变，或者将突变后的基因连接表达载体。 

引入599N密码子的定点突变引物： 

正向引物：5’-AACGCGACGACGAATCTTGGGCA-3’，下划线为突变碱基， 

反向引物：5’-TGCCCAAGATTCGTCGTCGCGTT-3’，下划线为突变碱基； 

双突变体A599N/Y633A的定点突变：利用快速PCR技术，以含单突变体A599N基因的表达载体/单突变体A599N基因为模板进行定点突变。 

引入633A密码子的定点突变引物： 

正向引物：5’-GTCGTTTACCAAGCACCGAACTG-3’，下划线为突变碱基， 

反向引物：5’-CAGTTCGGTGCTTGGTAAACGAC-3’，下划线为突变碱基； 

PCR反应体系均为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺Plus)10μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL，加入双蒸水32.5μL。