[发明专利]一种检测番茄斑萎病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病原的检测技术领域，具体涉及一种检测番茄斑萎病毒的方法。

背景技术

近年来，番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)以其广泛的寄主范围和造成的巨大经济损失已被列为世界危害最大的十种植物病毒之一。TSWV是TosPovirus属中最重要的一种病毒，广泛分布于世界各地的温带、亚热带及热带地区，侵染82科900多种单、双子叶植物，危害蔬菜、花卉及多种粮食作物如番茄、辣椒、马铃薯、花生、葛芭、豌豆、烟草、菊花、银莲花、百日草、大岩桐、大丽花及仙客来等，对许多经济作物及庭院植物造成严重损失。据报道，该病曾造成80％的花生损失、50％—90％的葛芭死亡，而在法国和西班牙等欧洲地区，随着介体西花蓟马的定殖与扩散，该病能够对番茄、辣椒及银莲花产生毁灭性危害，损失可达100％。

番茄斑萎病毒在寄主植物植株间的自然传播主要是通过蓟马媒介以持久性方式传播，该病毒在媒介昆虫体内自行复制增殖，提高了病毒的传播效率。目前，番茄斑萎病毒已在我国四川、广州、云南等多个地域存在，随着西花蓟马和番茄斑萎病毒交叉侵染越来越频繁，番茄斑萎病毒株系与西花蓟马的快速变异性都会导致因两种有害物种相互作用而造成严重经济损失。只有建立番茄斑萎病毒的快速确证方法，通过及时诊断和提前介入并快速处理，才能有效地在传播源头上遏制病毒的进一步扩散，在最短的时间内切断传播链。

目前，用于TSWV的检测及确证方法一般通过血清学、生物寄主、形态学试验判定植株是否具有植物病毒，这些方法费时，操作繁琐，不能满足病害防治的需要，同时显微镜检分析多依赖于人员的经验和专业背景知识，主观性较大；应用PCR技术检测确证时，如果引物特异性不强，可能出现检测假阳性；由于番茄斑萎病毒变异性较强，不同地理株系碱基差异程度较大，已有报道的引物很容易因位点变异导致出现假阳性等问题，因此，需要保守性更高、达到SNP级的检测引物或检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测番茄斑萎病毒的方法，从而克服现有技术在确证TSWV上存在的缺点，寻求提供一种TSWV焦磷酸测序技术确证方法，以克服现有检测技术的不足，为农业生产及生态环境监控提供一种快速、简便、高效、实用的TSWV确证检测方法。

本发明首先提供一种用于检测番茄斑萎病毒的引物组，序列信息如下：

Sequencing-F：5′-TAAGGCTTCCCTGGTGTCATAC-3′(SEQ ID NO:1)，5′进行生物素标记；

Sequencing-R：5′-CCATAATGCTGGGAGGTAGCT-3′(SEQ ID NO:2)，

Sequencing-测序引物:5′-GTTGATAGCTTTGAGATGA-3′(SEQ ID NO:3)。

本发明还提供用上述的引物组检测样品中是否存在番茄斑萎病毒，具体方法如下：

1)将提取的待测样品RNA进行RT-PCR扩增，逆转录后，扩增溶液中加入2×PCR buffer 12.5μL,10pmol/μL上游引物和下游引物各0.5μL，DEPC水补足体积至25μL，PCR循环条件为：94℃预变性5min后，进入94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共循环50次；然后72℃再延伸10min；

2)将PCR扩增产物电泳检测：取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3μL～6μL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。

3)制备焦磷酸测序单链模板：使用50μl标记有生物素的PCR产物与200μg链霉亲和素包被的磁珠，在室温25℃下孵育20分钟，用vacuum prep tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在70％乙醇中清洗5s；denatureation buffer洗5s；最后移到washing buffer中清洗10s；然后将vaccum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80℃烘箱2分钟，再冷却到室温；

焦磷酸测序反应：测序反应在室温下于焦磷酸测序仪上检测，加样使用600毫巴/8毫秒的加样压力和时间，每轮反应时间65秒，引物链随着不同dNTP的加入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。