[发明专利]一种测定原料和制剂中阿氏假囊酵母菌相对含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及测定药品、食品、饲料、肥料等原料和制剂中阿氏假囊酵母菌含量的新方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

酵母菌是一些单细胞真菌，在自然界广泛分布，主要生长在潮湿、含糖环境中，可在缺氧环境中生存。酵母菌是人类应用最早的微生物。

酵母菌主要功用是发酵。在面包和馒头生产中，酵母发酵产生大量二氧化碳使面团膨胀，形成松软的组织；在食品工业上常见的酵母菌有啤酒酵母，用于生产啤酒、白酒和酒精。

酵母菌功用之二是营养强化。人们发现酵母菌本身也具有很高的营养价值，氨基酸的比例接近联合国粮农组织(FAO)推荐的较理想的氨基酸组成值，其菌体含水量占干重的15%~25%，含蛋白质占干重的45%~60%，包括人体必需的氨基酸，特别是谷物蛋白中含量较少的赖氨酸。从酵母菌中提取的蛋白质色泽乳白，无异味，纯度高，主要作为营养强化剂添加到面包、饼干中，也添加到香肠、火腿等食品中，增强产品的口味。酵母菌中水溶性维生素和麦角甾醇(维生素D的前体)含量也非常丰富。值得一提的是，酵母菌富集硒元素，经过特殊工艺添加到食品后可以补充人体内的硒元素。目前市场上已有硒酵母片，适用于低硒的肿瘤、肝病、心脑血管疾病病人或其他低硒引起的疾病。

酵母菌功用之三是调味。酵母精也叫酵母味素，是以酵母为原料，经过使用酵母自身酶系或添加酶制剂进行分解消化，再经过滤、浓缩等精制而成的天然调味料。酵母精滋味鲜美，肉香味浓郁，后味悠长，并富含多种氨基酸、维生素及微量元素等，集调味与营养于一体，可与动物肉类提取物相媲美，广泛地应用于食品加工中。酵母精还具有缓和酸味、除去苦味、屏蔽成味及异味的效果。

酵母菌在食品、药品、饲料、化肥等方面有着重要作用，因此通过鉴别酵母菌和测定酵母菌含量来判断其发酵产品质量就显得非常必要。对于单纯酵母菌来说，酵母菌鉴别和含量测定较为简单，一是菌体烘干称重，二是直接取菌液，用分光光度计测其吸光度来推算菌体量，但是对于酵母菌发酵产品，酵母菌鉴别和含量测定极为不易。文献报道，有些学者采用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction， PCR）结合电泳检测法，或者采用实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，Real Time PCR）测定酵母菌特异DNA片段，来鉴别酵母菌和推算酵母菌发酵产品中酵母菌含量。

传统的酵母菌鉴定一般是通过表型特征，即形态观察和生理生化试验，根据结果判断菌株的种属，这种方式费时费力，重现性不好；另外由于环境影响，某些酵母菌表型特征差异不显著，传统的鉴定方法难以区分。近年来，采用遗传特性鉴定酵母菌有了突破，其中编码核糖体RNA基因内rDNA序列分析是重要的鉴定方法之一【杨静静，孟镇，钟其顶，熊正河，周韩玲，潘勤春，栾兴社. 分子生物学技术在酵母菌多相分类鉴定中的应用. 中国酿造2011，(4)：17-19】。

PCR结合荧光染色技术能准确定位rDNA基因位置【唐玲，刘平，黄瑛，杨江科，闽云君. 酵母的分子生物学鉴定. 生物技术通报 2008，(5):84-87】，测定rDNA序列（如26S rDNA的D1/D2、18S rDNA、ITS、5.8S rDNA）能鉴定物种同源性，该技术已被广泛应用于酵母菌的分类鉴定中【马爱瑛. rDNA 分析在真菌分类鉴定中的应用. 安徽农业科学2010，38(32):18079-18081】。